超高效液相色谱-串联质谱法同时检测毛发中3种新精神活性物质

祁观,仇文璞,白登文,柴一麟,杨淑颐,杨丽

(四川省毒品监测技术中心(国家毒品实验室四川分中心),四川 成都 610000)

合成大麻素是新型精神活性物质(New Psychoactive Substances,NPS)中滥用最严重、更新迭代最快的一类毒品,其种类占已知新精神活性物质的31.2%[1]。

与传统毒品四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol,Δ9-THC)相类似,合成大麻素进入人体后与CB1和CB2受体结合,入体后能够模拟△9-THC发挥作用且效力更显著,致幻性更强,有更好的成瘾性效果[2-5]。因为其隐蔽、低廉且难以被检测,常被用作传统毒品的替代品进行吸食,并且常被不法分子通过互联网渠道销售,常见形态有电子烟油、草药、香料等[6-7]。与此同时,近年来滥用合成大麻素的人数激加,导致急性中毒或死亡的案件越来越多,对人口的健康和公共安全构成严重威胁。合成大麻素是我国第一批受到管制的新型精神活性物质[8-9],对合成大麻素类新精神活性物质的进一步监测和精细化管理迫在眉睫。

近年来,国内外出现采用GC-MS、LC-MS/MS、UPLC-HR-MS对尿液、血液、体外肝微粒体中合成大麻素类物质经过液相萃取、固相萃取等方法处理后进行检测的报道[10-14],也有采用GC-MS、GC-MS/MS、LC/MS/MS对毛发检测的报道[15-18],但涵盖物质种类有限,难以满足实际案件检验鉴定需求。本文建立了一种灵敏、准确、高效的毛发中合成大麻素的检测方法,对肃清毒情隐患、服务禁毒大局具有重要意义。

由于合成大麻素在人体内广泛代谢,尿液、血液和唾液中几乎没有原型,因而针对毒品原型的检测方法极易导致该类毒品无法被检出,造成假阴性的结果[19]。毛发作为一种特殊的载体,在吸毒检验方面与尿液、血液、唾液等相比有不可比拟的优势:它检测窗口长,易收集和保存,无损伤性,不易掺假,灵敏度高,可长时间保留吸毒信息,同时,可以反映吸毒的时间范围、吸毒的程度和吸毒的变化,可以提供吸毒者长期用药情况,且可以避免暂时性药物切断或掺假毛的干扰。

毒品及其代谢物在毛发检材中的分布具有特殊性,人类头发是由角质层衍生而来的独特基质,其主要成分是角蛋白,按照血液中的毒品及其代谢物通过扩散进入毛囊的机制,血液中的毒品及其代谢物进入毛发中的能力是不同的。毒品及其代谢物进入毛发是在毛发形成期间,并且可以随着毛发生长进入发干[20]一般脂溶性强(极性小)的组分进入毛发的能力强,因此,毛发中的毒品及其代谢物的分布与血液、尿液中的分布不同,毛发中的毒品多以母体形式存在,代谢物的含量相对较低[21],正是由于毛发检材的独特优势,使毛发检测成为对合成大麻素类新精神活性物质监测最理想的检测手段[22]。

笔者所在实验室近1年来接收合成大麻素类相关案件数百例,其中最常见的为N-(1-氨甲酰基-2,2-二甲基丙基)-1-丁基吲唑-3-甲酰胺(ADB-BUTINACA)、1-戊基吲哚-3-甲酸-8-喹啉酯(PB-22)、N-(1-氨基-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)-1-(4-戊烯-1-基)-1H-吲唑-3-甲酰胺(ADB-4en-PINACA)3种合成大麻素类新精神活性物质。基于实际案件需要,设计本实验。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC I-Class TQ-XS 超高效液相色谱-串联质谱仪(美国 Waters 公司);Milli-Q Advantage 超纯水系统;YETO Vortex-2旋涡混合器;SCINTZ SB-5200D超声波清洗器。

标准品:ADB-BUTINACA,ADB-4en-PINACA,PB-22(国家毒品实验室);甲醇(色谱纯,Thermo Fisher Scientific);乙腈(色谱纯,Thermo Fisher Scientific);甲酸(色谱纯,Thermo Fisher Scientific);超纯水;空白毛发样品采集自10名无吸毒史的健康志愿者(男女性各5名,平均年龄26岁),用于制备校正曲线和质量控制(Quality Control,QC)样品。ADB-BUTINACA毛发实际样品(案件中缴获)。

1.2 色谱-质谱条件

1.2.1 色谱条件

选用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm ×100 mm,1.7 μm);A相(0.1%甲酸-水缓冲液);B相(0.1%甲酸-乙腈);流速0.4 mL/min;柱温40 ℃;洗脱梯度见表1。

表1 色谱洗脱梯度

1.2.2 质谱条件

离子化源模式:ESI+;雾化温度:450 ℃;扫描方式:多反应监测方式(MRM);毛细管电压:3.00 kV;脱溶剂气流量:800 L/h;碰撞气流量:0.15 mL/min;锥孔电压:20 V。各化合物参数见表2。

表2 3种化合物的质谱参数T

1.3 标准工作溶液与质控样的制备

3种NPS标准品均取适量溶于甲醇中,配制成质量浓度为10 μg/mL 的一级储备液,储存于冰箱(-20 ℃)中备用。取3种NPS的储备液各适量,用甲醇稀释成各组分质量浓度均为200 ng/mL的二级储备液。取二级储备液适量,加入等体积的A相缓冲液,配置成各NPS组分质量浓度均为100 ng/mL的标准使用液。取等体积的A相缓冲液与甲醇配置成稀释液,以100 ng/mL标准使用液为第一级使用稀释液逐级稀释,配置成0.2～40 ng/mL的系列标准溶液备用。

1.4 样品前处理

取头发置于蒸发皿中,用含0.1%十二烷基磺酸钠水溶液、去离子水、甲醇依次清洗,将蒸发皿中头发置于通风橱晾干,最后一次清洗液留存分析。称取头发20 mg装入破碎管,加入1 mL提取液(甲醇)。将破碎管放入研磨仪冷冻研磨5 min后,加入1 mL 0.1%甲酸水溶液,混匀,冰浴超声30 min后提取,经0.22 μm有机膜过滤后分析。

采用相同步骤做空白毛发试验。

2 定性实验方案及结果确认

2.1 选择性

2.1.1 目的

测试不同毛发基质和各种常见毒品是否会对ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的定性分析造成干扰。

2.1.2 实验方案

选取3种不同来源的空白毛发分别测定后按定性评价标准进行判定,确认不同空白基质是否导致假阳性情况。

将ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22标准工作溶液加入空白毛发中,经前处理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22质量浓度为20 ng/mL的溶液,分别测定后按定性评价标准进行判定,确认各物质是否会对除本身外其他2种目标物的分析导致假阳性情况。

2.1.3 实验结果

选择性实验结果见表3。

表3 选择性实验结果

由表3可知:空白毛发基质不会对ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22等3种目标物的定性分析造成干扰;ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22等3种目标物均不会对毛发中除本身以外的其他目标物的定性分析造成干扰。

2.2 检出限

2.2.1 目的

测试毛发中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22能被准确定性的最低浓度。

2.2.2 实验方案

将ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22标准工作溶液加入空白毛发中,经前处理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的5个不同质量浓度的溶液,分别为0.01,0.02,0.05,0.1和0.2 ng/mL,每个浓度重复测定10次,按定性评价标准进行判定,确认各浓度的阳性检出率,以阳性率100%的最低浓度作为定性检出限。

2.2.3 实验结果

检出限实验结果见表4。

表4 检出限实验结果

由表4可知:ADB-BUTINACA最低检出限为:0.1 ng/mL,ADB-4en-PINACA最低检出限为:0.2 ng/mL,PB-22最低检出限为:0.05 ng/mL。

2.3 稳健度

2.3.1 目的

测试实验中合理变化因素对定性结果的影响。

2.3.2 实验方案

将ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22标准工作溶液加入空白毛发中,经前处理后得到PB-22质量浓度为0.05 ng/mL的溶液1 份,ADB-BUTINACA质量浓度为0.1 ng/mL的溶液1 份,ADB-4en-PINACA质量浓度为0.2 ng/mL的溶液1份提取液放置24 h后再进行测定。

2.3.3 实验结果

稳健度实验结果见表5。

表5 稳健度实验结果

由表5可知:样品提取溶剂放置24 h对定性结果不会造成影响。

3 定量实验方案及结果确认

3.1 定量限和线性范围

3.1.1 目的

测试毛发中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22能被确定量的最低浓度,以及ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的色谱峰面积与浓度呈线性关系的浓度范围。

3.1.2 实验方案

将ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22标准工作溶液加入空白毛发中,经前处理后得到含ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的8个校准标准浓度点溶液,分别为0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10,20,40 ng/mL,每个校准标准浓度点重复测定10次,计算各浓度点的相对标准偏差RSD,确定RSD小于15%的最低浓度。以所有RSD小于15%的浓度为横坐标、各浓度点测得的面积为纵坐标绘制标准曲线,标准曲线采用线性回归,权重1/X。如果线性回归相关系数r大于0.998,且所有浓度拟合相对误差小于15%,则参与拟合的最低浓度为定量限,最低浓度至最高浓度为线性范围。如果线性回归相关系数小于0.998,或存在某个浓度拟合相对误差大于10%或在最低定量限附近RSD大于15%,则应舍去最低浓度,重新进行线性回归直至符合要求为止。

3.1.3 实验结果

各浓度点测定结果精密度分析结果见表6,线性范围分析结果见表7。

表6 各浓度点测定结果精密度分析

表7 线性范围分析

由表6、7可知,ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22最低定量限均为:0.2 ng/mL,在 0.2～40 ng/mL范围内具有良好的线性关系,R2均大于0.998。

3.2 准确度

3.2.1 目的

测试毛发中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22的定量结果是否存在偏倚。

3.2.2 实验方案

将ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22标准工作溶液加入空白毛发中,经前处理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22质量浓度为0.2,6,50 ng/mL的溶液,每个浓度点平行测定10次。准确度为测定平均值与参照值的百分比,其值应在90%～110%范围内,在最低定量限附近可在85%～115%范围内。

3.2.3 实验结果

准确度实验结果见表8。

表8 准确度实验结果

由表8可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22各浓度点准确度均满足要求。

3.3 重复性

3.3.1 目的

测试毛发中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22在重复性测量条件下测定结果的精密度。

3.3.2 实验方案

将ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22标准工作溶液加入空白毛发中,经前处理后得到ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22质量浓度为0.2,6,40 ng/mL的溶液。由同一实验人员使用同一仪器对样品平行测定10次,计算10次测定结果的相对标准偏差RSD。相对标准偏差RSD应小于10%,在最低定量限附近RSD可小于15%。

3.3.3 实验结果

重复性实验结果见表9。

表9 重复性实验结果

由表9可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22各浓度点重复性均满足要求。

3.4 提取回收率

3.4.1 目的

测试毛发中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22测定结果的提取回收率。

3.4.2 实验方案

将ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22标准工作溶液加入空白毛发中,经前处理后得到质量浓度为0.2和40 ng/mL的ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22溶液,每个浓度点6个平行样本,记录峰面积,计算6份样本平均峰面积Aa。分别利用空白毛发提取液配制对应浓度的分析物,每个浓度点6个平行样本,记录检测峰面积,计算6份样本平均峰面积Ab,提取回收率=Aa/Ab。提取回收率应在85%～115%范围,在最低定量限附近可在80%～120%范围。

3.4.3 实验结果

回收率实验结果见表10。

表10 回收率实验结果

由表10可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22回收率在94.63%～100.4%范围内。

3.5 基质效应

3.5.1 目的

测试毛发中ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22测定结果的基质效应。

3.5.2 实验方案

分别利用空白毛发提取液配制质量浓度为0.2和40 ng/mL的ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22溶液,每个浓度点6个平行样本,记录检测峰面积,计算6份样本平均峰面积Ab。配制质量浓度为0.2和40 ng/mL的ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22标准工作溶液,每个浓度点6 个平行样本,记录峰面积,计算6份样本平均峰面积Ac,基质效应=Ab/Ac。基质效应应在50%～150%范围。

3.5.3 实验结果

基质效应实验结果见表11。

表11 基质效应实验结果

由表11可知:ADB-BUTINACA、ADB-4en-PINACA、PB-22基质效应在93.47%～130.27%范围内。

4 实验结论

本实验定性检测的选择性和稳健度,定量检测的选择性、准确度、重复性、提取回收率和基质效应等特性参数均达到预期要求。本方法检出限、定量限、线性范围如表12所示。

表12 实验结论

该方法具有快速、灵敏、准确、适用性广等突出特点,能够满足相关合成大麻素在毛发中定性定量分析的要求,可以为相关案件中毛发中的新精神活性物质的检验鉴定提供借鉴。对于打击毒品犯罪、服务和保障人民群众的人身安全以及维护社会稳定具有重要的意义。

5 实际案例分析

将3份嫌疑人毛发样品经甲醇提取液破碎溶解后,与0.1%甲酸水溶液按1∶1体积比例,涡旋混匀后超声10 min,经0.22 μm 滤膜后,上机测试,在该检材中检出ADB-BUTINACA成分,样品与标准品的保留时间相对偏差小于2%,样品的定性离子和定量离子的相对离子丰度比在标准品相对离子丰度比率±10%范围内。经定量计算后,三位嫌疑人毛发中ADB-BUTINACA的含量为0.03,0.42,3.01 ng/mg。ADB-BUTINACA 20 ppb标准品和三份毛发案件样品色谱图如图1所示。

图1 ADB-BUTINACA 20 ppb标准品和三份毛发案件样品色谱图