三种外源物质对镉胁迫下紫花苜蓿种子萌发的影响

凌立贞, 李常荣, 张书东

(六盘水师范学院生物科学与技术学院, 贵州 六盘水 553004)

随着农药和化肥在我国农业生产过程中的大量使用,农用耕地污染问题日趋严重。2014年《全国土壤污染状况调查公报》[1]公布的我国农用耕地土壤污染点位超标率为19.4%,其中轻度、中度和重度污染点位比例分别为2.8%,1.8%和1.1%,而重金属是其主要污染物,如镉(Cd)、镍(Ni)、铜(Cu)、砷(As)、汞(Hg)、铅(Pb)等。据不完全统计,我国每年因重金属污染的粮食高达1 200万t,造成了巨大的经济损失和粮食浪费[2-3]。除人为因素造成的土壤重金属污染外,重金属元素还可通过岩石风化、森林大火和火山爆发释放等自然现象进入环境[4],从而加剧土壤的污染状况。

在我国,Cd污染点位超标率达7%,Cd已经成为我国耕地土壤最严重的重金属污染物。据报道我国农田重金属Cd污染面积已达2×104hm2,每年有14.6×108kg农产品Cd含量超标,且有日益增加的趋势[5]。Cd不是植物生长的必需元素,Cd含量过高会导致植物生长缓慢,光合系统、气孔运动、酶活性、蛋白质代谢和膜功能发生异常变化,从而造成叶绿体结构破坏,激化叶绿素分解,阻断营养元素向上运输等危害[6]。此外,土壤中的Cd容易被植物吸收积累,并通过食物链进入人体,从而危害人类的身体健康[7-8]。Cd超标能够引起肝脏、肾脏、骨骼、生殖、呼吸系统等方面的损害,居住在Cd污染区的人们患上述疾病的风险性更高[9]。为减少土壤中Cd元素对植物和人体的伤害,研究人员研发出了多种土壤修复技术,部分取得明显成效并在实践中得以应用。目前,生物修复技术因具有操作简单、成本低、无二次污染等优点被广泛应用于修复重金属Cd等污染的土壤[10-11]。在此修复方式中寻找最佳超富集植物是实施土壤修复的关键。紫花苜蓿(Medicagosativa)为豆科苜蓿属多年生草本植物,可以在缺少营养、盐碱、干旱等不良环境条件下生长[12],是广泛种植的牧草作物,其发达根系上的根瘤具有固氮作用,还可以提高土壤肥力。紫花苜蓿对Cd、Zn、Cu及Ni等多种重金属元素具有较高的富集功能,在重金属污染土壤的生态修复中起着极为重要的作用[13-14]。

种子萌发是植物生长起始的重要阶段,对环境变化感应非常敏感。多项研究表明,低浓度Cd胁迫对植物种子的萌发没有明显的抑制效果,有的甚至提高了种子的发芽率、发芽势、发芽指数等指标,而中高浓度的Cd处理会明显降低植物种子的萌发指标。如田丹等[15]研究表明,低浓度的Cd处理(1 mg/L)对生菜的萌发无明显影响,当Cd浓度高于10 mg/L时明显降低生菜种子的萌发指标。因此,多数情况下研究人员会把种子萌发阶段作为植物耐Cd性评价的关键阶段。此外,一些研究发现,通过施加外源物质可以减轻Cd对植物的毒害作用。如施加外源柠檬酸(CA)能有效缓解Cd胁迫对植物生长的抑制,减少活性氧的含量而增加抗性物质的含量[16];施加外源3-吲哚乙酸(IAA)能促进叶绿素a和叶绿素b的合成,增大光合作用强度和提高抗氧化酶的活性来缓解Cd对植物的毒害作用[17];适当浓度的水杨酸(SA)处理莴苣种子可以缓解Cd对其种子萌发和幼苗生长的伤害[18]。

为加大紫花苜蓿在Cd污染土壤修复中的应用,本研究以高产型维多利亚紫花苜蓿为研究材料,通过在明显开始抑制紫花苜蓿种子萌发的Cd浓度下施加三种外源物质CA、SA和IAA,检测施加不同外源物质对Cd胁迫下紫花苜蓿种子萌发的影响。这些研究结果将对于紫花苜蓿缓解Cd2+的毒害作用和在重金属Cd污染土壤开展修复改良工作具有重要意义,同时,也为其他重金属富集植物的研究提供借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1材 料

本试验所使用的紫花苜蓿品种为维多利亚,种子购买于蓝天种子公司。

1.1.2主要药品试剂

氯化镉(CdCl2)、无水乙醇(C2H6O)、柠檬酸(CA)、3-吲哚乙酸(IAA)、水杨酸(SA)。

1.2 实验方法

1.2.1抑制紫花苜蓿种子萌发的Cd浓度检测

挑选饱满程度一致,无虫害和不破损的种子,用5%的次氯酸钠溶液浸泡20 min进行消毒后,用蒸馏水冲洗3～5遍,再用75%的酒精消毒5 s后,用蒸馏水冲洗3遍。用滤纸把种子上的水吸干备用。

在培养皿(直径9 cm)中铺垫2层滤纸,取100粒消毒后紫花苜蓿种子放置在培养皿中,加入等量不同浓度的CdCl2溶液,溶液以浸湿滤纸为宜,每个浓度处理3个重复。将培养皿放于25 ℃光照培养箱中培养,每天观察记录种子发芽数(按胚根与种子等长/胚芽长度达到种子长的一半为发芽标准),持续10 d后结束。在种子培养到第4天的时候,计算种子的发芽势,在种子培养第10天完成时,计算种子的发芽率、发芽指数和活力指数,并精确测量其芽长、根长(单位cm,保留小数点后两位)。共设置6个浓度梯度(5,10,20,50,100,200 mg/L)的CdCl2溶液处理紫花苜蓿种子,以无菌水处理作为对照。通过以上种子萌发指标的比较,筛选出明显抑制紫花苜蓿种子萌发的CdCl2溶液浓度。

1.2.2外源物质缓解Cd胁迫下紫花苜蓿萌发情况

实验所用的3种外源物质分别为水杨酸(SA)、3-吲哚乙酸(IAA)及柠檬酸(CA)。SA溶液浓度梯度设置为50,100,200,400 μmol/L;IAA浓度配制为10,25,50,100 μmol/L;CA浓度设置为1,2,4,8 mmol/L。

将紫花苜蓿种子用上述浓度的CA、IAA和SA溶液浸种4 h,浸种完成后用蒸馏水反复冲洗种子并用滤纸吸干表面水分。将种子均匀整齐地铺在有两层滤纸的培养皿里,每皿50粒种子,每个处理3个重复。根据1.2.1试验结果在每个培养皿中加入100 mg/L CdCl2溶液。将处理好的种子放在温度为25 ℃的光照培养箱中进行培养。每天观察记录种子发芽数,最终统计发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等指标。

1.3 发芽指标的计算

发芽率/%=(总的发芽种子数/供试种子数)×100%;

发芽势/%=(第4天时种子发芽数/供试种子数)×100%;

发芽指数(Gi)=∑(Gt/Dt),

式中:Gt表示第t天的种子发芽数,Dt表示对应种子的发芽天数。

活力指数(Vi)=Gi×S=∑(Gt/Dt)×S,

式中:Gi表示发芽指数,S表示紫花苜蓿幼苗芽长,单位cm(保留小数点后两位)。

1.4 数据处理与分析

数据采用SPSS19软件进行单因素方差分析及差异显著性检验,并采用Microsoft Office2016软件进行数据处理及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 Cd对紫花苜蓿种子萌发的影响

本研究用6个浓度梯度的CdCl2处理维多利亚紫花苜蓿,观察其对Cd的耐受情况。由图1可以看出,随着CdCl2浓度的逐渐增加,紫花苜蓿种子的4个萌发指标(发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数)均呈下降趋势。但是这4个萌发指标与对照组比较,呈显著下降时的CdCl2溶液浓度并不完全相同。紫花苜蓿在CdCl2浓度为100 mg/L时发芽率为74.67%,与对照(94.00%)相比差异显著(p<0.05)(图1 a);而在200 mg/L时,紫花苜蓿的种子萌发才受到严重限制,仅有23.67%的种子萌发(图1a)。发芽势与发芽率具有相似的下降趋势,但在CdCl2浓度为50 mg/L时与对照相比已经出现了显著性差异(图1 b)。发芽指数和活力指数的变化趋势基本一致,分别在CdCl2浓度为5 mg/L和20 mg/L时出现了小幅度的回升,但是发芽指数在这些CdCl2浓度下与对照均没有明显差异,当CdCl2浓度上升到50 mg/L时,与对照相比差异显著(图1 c)。就活力指数而言,在低浓度(10 mg/L)时出现显著下降,而在高浓度(200 mg/L)的CdCl2溶液胁迫下活力指数几乎为0(图1 d)。基于以上结果可知,Cd对紫花苜蓿种子萌发随着浓度的增加,抑制程度也增加。综合4个萌发指标,选定100 mg/L的CdCl2溶液作为后续的缓解Cd胁迫实验用浓度。

注:A为萌发率;B为发芽势;C为发芽指数;D为活力指数。图1 镉对紫花苜蓿种子4种萌发指标的影响

2.2 外源物质对Cd胁迫下紫花苜蓿种子萌发的影响

由表1可以看出,100 mg/L CdCl2溶液对紫花苜蓿种子的胁迫作用在外施三种外源物质后均出现了不同程度的缓解。在CA处理后,随着浸种CA浓度的升高,Cd胁迫下的紫花苜蓿种子发芽率和发芽指数均有所升高,但是与单独的Cd处理相比均无明显差异;发芽势和活力指数两个萌发指标都呈现出先上升后下降的趋势,但是在施加中低浓度(<4 mmol/L)的CA后均出现了显著性上升(表1)。SA浸泡紫花苜蓿种子后,Cd胁迫下发芽率和发芽指数均没有明显的变化;而发芽势和活力指数在分别施加10 μmg/L和25 μmg/L的SA后显著增加(表1)。但与CA不同的是,外源施加SA后各项指标均呈上升的变化趋势。不同浓度IAA浸种后,在100 mg/L Cd胁迫下紫花苜蓿种子各项萌发指标均表现出先增后降的变化趋势。这种趋势与施加外源的CA是相同的。在4个萌发指标中,除了发芽指数外其他3个萌发指标(发芽率、发芽势和活力指数)均在施加外源的IAA后有所上升,且与对照相比都出现显著性增加(p<0.05)(表1)。由此可知,这三种外源物质浸种紫花苜蓿种子均有缓解Cd胁迫的作用。

表1 施加外源CA、IAA和SA对Cd胁迫紫花苜蓿种子萌发的影响

3 讨 论

紫花苜蓿是一种广泛种植的牧草,对Cd具有一定的耐受性[19]。但是,不同的紫花苜蓿品种对Cd胁迫的耐受性存在较大的差异,如阿尔冈金紫花苜蓿在低浓度(5 mg/L)Cd胁迫下种子的萌发就受到了明显的抑制[20],与本试验结果显示的维多利亚紫花苜蓿在较高浓度(100 mg/L)Cd胁迫下种子4个萌发指标产生了明显下降,存在较大的差异。为深入研究施加外源物质对Cd胁迫的缓解作用,本研究采用了100 mg/L的CdCl2溶液作为胁迫浓度开展试验。种子萌发是植物感应外界环境的初始阶段,是植物生活史的一个重要组成部分。在遭受重金属胁迫时,其种子萌发指标:发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等会产生相应的变化。本试验采用三种外源物质(IAA,CA和SA)处理紫花苜蓿种子后,这4个萌发指标反应的敏感性不同。发芽率只有在紫花苜蓿种子施加外源IAA时对Cd胁迫才有缓解作用,CA和SA即使在高浓度时对发芽率的缓解效果也不明显(表1)。而发芽势是最敏感的一个萌发指标,在三种外源物质浸种后都表现出了显著上升,其中施加IAA和CA后都达到了无Cd胁迫时的水平(91%),而施加SA后紫花苜蓿种子的发芽势尽管一直处于上升的趋势,但是在本试验所用的浓度下最高达到了88%(表1),不及无Cd胁迫时的水平。发芽指数是最不敏感的一个萌发指标,不管是外源物质的种类还是浓度的高低均没有影响这个指标。活力指标与发芽势相似,对三种外源物质的施加非常敏感,除低浓度的SA(10 μmg/L)外,其他浓度的SA、CA和IAA都对Cd胁迫下的紫花苜蓿种子胁迫作用有显著的缓解效果。因此,这些分析表明本实验中发芽指数不适用于作为指示外源物质缓解Cd毒害作用的一个生理指标。

施用外源物质能够有效地控制Cd污染对农作物的毒害作用。其中,这些外源物质种类比较多,主要包括致酸性外源物质、土壤改良剂、稀土元素和微生物等[21]。本试验发现施加三种致酸性外源物质(CA、IAA和SA)对紫花苜蓿种子的Cd毒害都有明显的缓解效果。前期研究表明CA、IAA和SA能够缓解多种植物的Cd毒害作用。如,外施SA能够显著缓解Cd对小报春和孔雀草幼苗的毒害作用[22-23]。同样地,在栝楼叶片上喷施IAA溶液或者在用CA处理绵毛水苏、披碱草、小白菜、龙葵、棉花等都能缓解Cd胁迫的影响[16-17,24-25]。这些外源物质基本上都是通过调节植物的抗氧化系统和光合系统来增强植物的抗性或者是通过抑制Cd在植物体内的吸收和转运等方式来缓解Cd的毒害作用[22]。本试验中这三种外源物质对维多利亚紫花苜蓿品种受到Cd毒害的缓解机制还需要进一步的研究。

4 结 论

综上所述,Cd胁迫对维多利亚紫花苜蓿的种子萌发产生明显的抑制作用,尤其是在浓度100 mg/L以上时4个萌发指标(萌发率、发芽势、发芽指数和活力指数)均显著下降。为减轻Cd胁迫作用,利用三种外源物质(CA、SA和IAA)处理100 mg/L CdCl2胁迫维多利亚种子,发现这三种外源物质均能产生有效的缓解作用。其中发芽指数在这三个外源物质处理后均无明显变化。因此,在本试验中发芽指数不适合作为检测Cd毒害缓解效果的一种生理指标。