紫杉醇聚乳酸微球的制备及其抗胃癌活性评价

孙彬成，刘静，李君

1 巴彦淖尔市医院消化内科，内蒙古巴彦淖尔 015000；2 内蒙古医科大学药学院

紫杉醇（PTX）系一种二萜类化合物，来源于红豆杉属植物［1］，于20世纪发现并具有广谱、高效作用的抗癌治疗药物。目前，紫杉醇在临床主要被用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、大肠癌、胃癌等的一线治疗［2］，但其水溶性差，临床使用范围受限。目前临床应用的剂型主要为紫杉醇注射液Taxol®［3］，但其溶媒聚氧乙烯蓖麻油不良反应较强，可引发过敏、低血压和神经脱髓鞘等不良生理病理反应［4］。微球（MPS）给药系统的粒径1~250 μm，具有吸收良好、生物利用度高，药物缓释等优点［5］，同时，微球给药系统处方中仅含有少量稳定剂，不良反应发生率大大降低。因此，微球给药系统现已广泛用于生物制药领域［6］。聚乳酸（PLA）是一种高分子聚合物，其分子构象存在三种异构体：左旋聚乳酸（PLLA）、右旋聚乳酸（PDLA）、外消旋聚乳酸（PDLLA），其中左旋聚乳酸PLLA生物相容性良好，可被最终降解为CO2和H2O，而其中间产物左旋乳酸（LLA）能被人体代谢吸收。目前，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准为安全的药用辅料［7-8］。2019年6月—2021年6月，本研究通过制备载紫杉醇聚乳酸微球（PTX-PLLA-MPS），建立含量测定方法，优化制备工艺，并对其体外释放行为及抗胃癌活性进行初步评价。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃癌细胞SGC7901由内蒙古大学生命科学学院提供；裸鼠30只，体质量20~22 g，雌雄不限，购自北京斯贝福生物技术有限公司，SCXK（京）2019-0010，实验动物饲养于内蒙古医科大学新药安评中心小动物饲养屏障设施。紫杉醇PTX（Lot number：20200927，纯度：99.20%，成都曼思特生物科技有限公司）；0588低黏度型聚乙烯醇（Lot num‐ber：J1918087，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；PLLA（批号：20190511，成都曼思特生物科技有限公司）；胎牛血清（Lot number：04-001-1ACS，BI）；1640培养基（Lot number：210359，Hyclone）；培养皿、96孔板等（康宁）无水乙醇、甲醇等（翁江化学试剂有限公司）。高效液相色谱仪（Agilent-1260，Agilent Technologies Inc）；电子天平（AR224CN，奥豪斯仪器上海有限公司），超声波清洗机（SB25-12DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司）；电热恒温培养箱（DNP-9162型，上海精宏实验设备有限公司）；电子天平（DT-500B，常熟市佳衡天平仪器有限公司）；纯水机［Milli-Q，美国默克密理博实验室设备（上海）有限公司］；光学显微镜（DM-2000，德国徕卡仪器有限公司）；动态光散射纳米颗粒分析仪（SZ-100，堀场仪器上海有限公司）；酶标仪（Multiskan MK3，Thermo Fisher Inc）。

1.2 方法

1.2.1 PTX-PLLA-MPS的制备 根据相关文献［9-10］报道，以PLLA为载体，采用溶剂挥发法制备PTXPLLA-MPS，具体步骤：取200 mg PLLA和100 mg PTX于5 mL二氯甲烷中，超声振荡5 min使之完全溶解作为油相，将油相缓慢逐滴快速滴入水相（50 mL 1%聚乙烯醇PVA溶液）中，油相加入后，溶液过高速均质机，随后磁力搅拌有机溶剂挥发后，5 000 r/min离心10 min（离心半径13.5 cm），收集沉淀微球，蒸馏水洗涤后冷冻干燥制得微球，工艺流程如图1所示。

图1 PTX-PLLA-MPS制备工艺流程示意图

1.2.2 溶液配制 紫杉醇对照品的配制：秤取紫杉醇PTX对照品100 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇40 mL，超声20 min，冷却至室温，加甲醇至刻度，摇匀，即得2 mg/mL对照品溶液。PTX-PLLA-MPS的配制：秤取PTX-PLLA-MPS 100 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加40 mL甲醇，超声20 min，冷却至室温，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，摇匀，即得供试品溶液。秤取不含紫杉醇PTX的空白微球（MPS），按照供试品溶液配制方法制备阴性对照品溶液。

1.2.3 专属性、线性、仪器精密度、稳定性和回收率检测 采用高效液相色谱法。按照如下色谱条件进样测定，色谱柱：kromasil 100-5-NH2 C18柱（250 mm×4.6 mm 5 μm），流动相甲醇：水（67∶33），进样量：10 μL，流速：1 mL/min，检测波长：227 nm，柱温：（35 ± 0.5）℃。专属性测定：取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液，按色谱条件进行测定，记录色谱图。线性关系测定：精密吸取上述2 mg/mL对照品溶液，配制成系列梯度：10、20、40、100、200、400及600 μg/mL的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，按色谱条件进样测定，以峰面积（Y）对浓度（X）做线性回归曲线。精密度测定：分别配制100、200及400 μg/mL的低、中、高紫杉醇PTX标准品溶液，按色谱条件进样测定。稳定性测定：取400 μg/mL紫杉醇PTX标准溶液，过0.45 μm微孔滤膜，按色谱条件进样测定，在室温环境条件下，分别于0、2、4、6、12及24 h取样测定峰面积。回收率的测定：采用加样回收试验。取10 mg微球分别加入12、15和18 mg紫杉醇原料药进行回收率的测定。

1.2.4 紫杉醇微球正交工艺优化 根据文献［11-12］，实验选取水相中PVA浓度（A）、油相水相体积比（B）、油相中PLLA浓度（C）及PLLA/PTX比（D）四个因素，每个因素设置3个水平，以载药量和包封率综合评分为评价指标，运用正交实验设计方法优化制备工艺，综合评分为载药量和包封率的和。L9（34）正交实验因素水平表、正交实验设计如表1所示。

表1 正交因素水平表

1.2.5 微球形态、粒径分布测定 以最优制备工艺条件制备PTX-PLLA-MPS，取适量微球于载玻片上，加去离子水使之分散，通过光镜观察微球形态为球形且无聚集，采用光学显微镜观察其形态，采用粒径仪测定微球粒径及Zeta电位。

1.2.6 载药量和包封率测定 秤取PTX-PLLAMPS 10 mg于10 mL容量瓶中，加入无水乙醇2 mL超声15 min，加甲醇稀释至刻度，按“1.2.3”项下方法测定紫杉醇含量，微球载药量（%）=（微球中含药量/微球质量）×100%，微球包封率（%）=（微球中含药量/理论投药量）×100%。

1.2.7 PTX-PLLA-MPS体外释放情况观察 参考文献［13］方法，秤取20 mg PTX-PLLA-MPS 3批次，分别置于50 mL离心管中，分别加入50 mL蒸馏水释放介质（含0.5%聚山梨酯-80），混匀后，在37 ℃恒温振荡器以100 r/min振荡，分别于1、2、4、6、9、12、15、18及21天取1 mL释放介质，同时补充1 mL空白释放介质，过0.45 μm微孔滤膜后按“1.2.3”项下方法测定紫杉醇含量，计算累积释放率，并绘制释放曲线。

1.2.8 各组细胞活力检测 采用SGC7901细胞增殖实验。人胃癌SGC7901细胞生长至80%~90%密度时，PBS清洗，0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度至4×106/mL，将细胞接种于康宁96孔板。过夜培养后，随机设置空白微球组、PTX组、PTX-PLLAMPS组，分别加入30 μg/mL空白微球、30 μg/mL PTX、30 μg/mL PTX-PLLA-MPS处理24、48、72 h。加入CCK-8溶液（体积比1∶10），在恒温细胞培养箱中孵育2 h后，MK3酶标仪在490 nm波长下测量其吸光度。按照公式：细胞活力（%）=给药孔的吸光度/空白对照的吸光度×100%计算各组细胞活力。

1.2.9 裸鼠荷瘤生长情况观察 使用胰蛋白酶消化人胃癌细胞SGC7901，调整细胞浓度后，皮下注射到裸鼠前肢腋下，注射体积为0.2 mL/只，建立裸鼠荷瘤模型。选取成瘤裸鼠15只，按体质量随机分为3组：模型组、PTX组和PTX-PLLA-MPS组，尾静脉注射给药，2 d一次，给药剂量15 mg/kg。根据公式计算肿瘤体积（V），V = a × b2× 0.5（a肿瘤最大直径，b为肿瘤最小直径），绘制肿瘤生长曲线。

1.2.10 统计学方法 使用SPSS20.0统计软件。计量资料符合正态分布以表示，双尾t检验评估两组间的差异，多组比较使用重复测量方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 专属性结果 如图2B和2C所示，紫杉醇PTX的保留时间（RT）约3.514 min；由图2A可知，实验过程所用其他辅料及试剂等对紫杉醇含量测定无干扰。

图2 空白微球（A）、紫杉醇标准品（B）、供试品（C）的高效液相色谱图

2.2 线性测定结果 以峰面积（Y）对浓度（X）做线性回归曲线，可得Y=62.281X-168.91，R2=0.999 2，紫杉醇PTX浓度在10~400 μg/mL范围内线性良好。

2.3 仪器精密度结果 低、中、高紫杉醇PTX标准品溶液对应的RSD分别为0.08%、0.19%、0.08%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性结果 在室温环境条件下，分别于0、2、4、6、12及24 h取样测定峰面积，0~24 h紫杉醇峰PTX的峰面积RSD为0.27%，表明紫杉醇PTX溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.5 加样回收结果 取10 mg微球分别加入12、15和18 mg紫杉醇原料药进行回收率的测定，结果回收率分别为99.61 %、100.18 %、99.72 %，相应RSD分别为1.01%、1.42%和0.96%，表明该方法回收率良好，符合分析要求。

2.6 紫杉醇微球最佳制备工艺 A因素的极差R值最大，所以影响紫杉醇微球载药量和包封率的因素主次顺序：A>D>B>C，通过4因素3水平K值分析比较可知，PVA质量浓度A1>A3>A2，油水相体积比B1>B2>B3，PLLA质量浓度C2>C1>C3，PLLA/PTX比D3>D2>D1；根据方差分析表可知，A、B、C、D因素对微球载药量和包封率均无显著性影响，可以确定紫杉醇微球最优制备工艺为A1B1C2D3，即PVA浓度为1.0%，油水体积比为1∶10，PLLA质量浓度为6%，PLLA/PTX质量比为6∶1。

2.7 微球形态、粒径分布、载药量及包封率 以最优制备工艺条件制备PTX-PLLA-MPS，肉眼观察为细腻粉末状，微球粒径为（1.23 ± 0.21）μm，Zeta电位（3.67 ± 1.42）mV；测得三批微球平均载药量为（18.23 ± 1.40）%、包封率为（74.00 ± 1.49）%。

2.8 PTX-PLLA-MPS体外释放测定结果 所得PTX-PLLA-MPS第1天体外释放率为（9.43 ±3.12）%，未出现突释现象，在第6天有明显释放过程，累积释放率为（43.65 ± 1.65）%，随后各测量点释放趋于平稳，第21天累积释放率为（76.20 ±3.46）%。

2.9 PTX-PLLA-MP抗胃癌活性初步评价［13］

2.9.1 各组SGC7901细胞活力比较 见表2。

表2 各组SGC7901细胞活力比较（）

表2 各组SGC7901细胞活力比较（）

注：与空白微球组比较，*P<0.01；与PTX组比较，#P<0.05。

72 h 92.50 ± 1.85 61.93 ± 1.54*52.22 ± 2.74*#组别细胞活力（%）空白微球组PTX组PTX-PLLA-MPS组24 h 97.50 ± 3.29 82.50 ± 1.49*77.02 ± 5.34*48 h 93.50 ± 3.09 72.13 ± 3.49*62.59 ± 4.29*#

2.9.2 各组荷瘤裸鼠肿瘤体积比较 见表3。

表3 各组肿瘤体积比较（）

表3 各组肿瘤体积比较（）

注：与模型组比较，*P<0.01；与PTX组比较，#P<0.05。

组别模型组PTX组PTX-PLLA-MPS组肿瘤体积（mm3）56 d 1 533.50 ± 30.49 642.50 ± 20.49*782.50 ± 26.50*#14 d 30.99 ± 1.25 28.95 ± 1.20 28.50 ± 1.50 28 d 334.04 ± 2.45 304.50 ± 3.49*335.50 ± 4.49#42 d 756.50 ± 14.19 537.49 ± 12.19*576.50 ± 9.19*#

3 讨论

紫杉醇作为临床一线抗癌药物，由于其剂型原因极大限制了其临床应用，同时其引起的过敏反应给患者带来诸多不适，为避免其不良反应，目前研制了紫杉醇白蛋白、紫杉醇脂质体等剂型［14］，PLLA作为无毒且可生物降解材料，常用作缓释微球载体。目前，制备微球常用方法有单/复乳溶剂挥发法、喷雾干燥法及超临界流体法等；根据紫杉醇溶解性结合相关文献报道［11］，本研究对紫杉醇聚乳酸微球进行了系统实验，通过溶剂挥发法制备载紫杉醇聚乳酸微球，在预实验过程中，由于PVA在低温条件溶解较慢，故对其进行了加热、超声等操作，然而在将油相加入到PVA水溶液过程中，由于二氯甲烷沸点较低，引起沸腾，所以在PVA充分溶解的情况下选择在冰浴条件下缓慢加入油相；同时，对油相加入速度进行了考察，结果发现快速将油相加入到水相致使油相聚集，不宜形成微球，所以油相加入过程应逐滴缓慢加入。

本研究采用高效液相色谱法测定微球中紫杉醇含量，结果紫杉醇质量浓度在10~600 μg/mL线性良好，精密度、加样回收率RSD均在2%以内，表明该方法符合分析要求。

为了解所制备微球的释放行为，本研究选择蒸馏水为释放介质考察体外释放行为，结果表明微球在释放介质中呈缓释趋势，在最初4天释放较为缓慢，然而在第6天有明显释放，分析原因可能与药物在微球骨架中分布有关，在随后各测量点释放缓慢增加，第21天累积释放率为（76.20 ± 3.46）%。然而药物在体内的释放是一个极为复杂的过程，不仅有PLLA的水解、断裂及药物释放，还包括多种酶系统的降解反应，所以体外释放实验带有一定局限性，故不能完全代表药物体内的释放过程；同时，采用溶剂挥发法制备微球需可挥发有机溶剂的参与，致使微球内不可避免的残留少量有机溶剂，所以后期进行细胞层面及动物层面的毒性研究研究仍具有重要意义。

在建立裸鼠荷瘤模型试验中，预实验注射的细胞数量为细胞浓度为5×106个/点，然而肿瘤生长过快，肿瘤块出现坏死现象，且给药次数受限。经过梯度筛选，最终确定成瘤需注射的细胞数量为2×106个/点。建立裸鼠荷瘤模型时，由于实验动物之间存在个体差异，所以要进行筛选，将肿瘤生长明显异常的实验动物剔除，从而保证实验结果的准确性。动物实验过程中，尾静脉注射应缓慢给药，避免因注射过快而出现急性毒性反应。

综上所述，在本实验条件下，采用溶剂挥发法，通过正交优化实验成功制备了PTX-PLLA-MPS，在PVA浓度为1.0% ，油水体积比为1∶10，PLLA质量浓度为6%，PLLA/PTX质量比为6∶1的工艺条件下所得微球形态圆整，粒径分布均匀，体外具有明显缓释过程，同时，通过细胞增殖和裸鼠荷瘤实验证明PTX-PLLA-MPS具有较好抗胃癌活性。