上皮性卵巢癌组织中miR-515-5p、CSPG4的表达及临床意义

陈益波，林永红，张丛敏

1 崇州市妇幼保健院妇科，四川崇州 611230；2 成都市妇女儿童中心医院妇科

卵巢癌是临床常见的女性生殖系统恶性肿瘤。据2020年国际癌症研究机构报告，我国新发卵巢癌病例5.5万例，死亡3.8万例，其发病率居宫颈癌和子宫体恶性肿瘤之后，但病死率居所有女性生殖系统恶性肿瘤之首，疾病负担严重［1］。上皮性卵巢癌（EOC）是卵巢癌最常见类型，占所有卵巢癌的80%，尽管近年来卵巢癌的诊治取得了一定进展，但EOC患者预后仍较差［2］。研究表明，微小RNA（miRNA）通过多条信号通路活化参与卵巢癌发生、发展［3］。研究报道，miR-515-5p参与胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭与凋亡等过程［4］。硫酸软骨素蛋白聚糖4（CSPG4）是一种细胞表面蛋白，能通过结合肌动蛋白细胞骨架激活一系列信号效应因子［5］。研究报道，CSPG4参与黑色素瘤、皮肤鳞状细胞癌等恶性肿瘤进展［6］。目前，关于EOC组织中miR-515-5p、CSPG4表达及临床意义的研究报道不多。本研究旨在通过检测EOC组织中miR-515-5p、CSPG4表达，探讨二者的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月—2019年12月崇州市妇幼保健院收治的84例EOC患者，年龄31～81（55.35 ± 7.26）岁。病理类型：浆液性癌67例、黏液性癌17例；肿瘤最大径：≥3 cm 33例、<3 cm 51例；组织分化程度：低分化31例、中高分化53例；国际妇产科联盟（FIGO）分期：Ⅰ期16例、Ⅱ期17例、Ⅲ期51例；淋巴结转移36例。纳入标准：①经病理证实为卵巢癌；②初诊且未接受过抗肿瘤治疗；③入院接受根治性或姑息性手术；④年龄≥18岁；⑤患者或家属知情并签署同意书。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤或既往恶性肿瘤；②合并血液、免疫系统损害；③妊娠及哺乳期妇女；④院内死亡或不能接受随访。本研究经医院伦理委员会批准。患者出院后通过门诊或电话随访3年，随访截止2022年12月或死亡。

1.2 EOC组织中miR-515-5p、CSPG4表达检测 术中切除部分癌组织和癌旁部分正常组织（经病理检查为正常组织），液氮冷冻后保存于－80 ℃冰箱中。取部分冻存组织，液氮下研磨成末，TRIzol法提取组织总RNA，鉴定RNA纯度、浓度合格后，使用TaKaRa RNA PCR Kit试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司，编号：RR024A）合成cDNA。引物设计和合成由北京环中睿驰科技有限公司完成。miR-515-5p引物：正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；内参U6引物：正向引物5′-AGCGCCTTGACCTGGACA-3′，反向引物5′-TCGGCGTGCTCTGGAAAA-3′；CSPG4引物：正向引物5′-GTTGCATAGGTCCCTCGGTT-3′，反向引物5′-CGTAGCCAAAGACGAACATGC-3′；内参GAPDH引物：正向引物5′-GAGAAACCTGCCAAGTATGAT‐GAC-3′，反向引物5′-GGAGTTGCTGTTGAAGTCAC-3′。参考SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒（北京智杰方远科技有限公司，编号：DRR041A）说明书和使用PCR仪（美国ABI，型号：ABI7500）进行扩增，反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循环40次后收集Ct值，2-ΔΔCT法计算组织中miR-515-5p、CSPG4 mRNA相对表达量。根据EOC组织中miR-515-5p、CSPG4 mRNA表达均值分为高、低表达，统计EOC患者累积生存率。

1.3 统计学方法 采用SPSS28.0统计软件。正态分布计量资料以表示，比较采用t检验；计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验；采用Pearson相关系数分析EOC组织中miR-515-5p与CSPG4 mRNA表达的相关性；Kaplan-Meier法绘制不同miR-515-5p、CSPG4 mRNA表达EOC患者生存曲线，组间生存率比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EOC组织与癌旁组织中miR-515-5p、CSPG4 mRNA表达比较 EOC组织与癌旁组织中miR-515-5p mRNA相对表达量分别为0.96 ± 0.22、1.23 ± 0.27，CSPG4 mRNA相对表达量分别为1.37 ± 0.33、1.06 ±0.21，EOC组织中miR-515-5p表达低于癌旁组织，CSPG4 mRNA表达高于癌旁组织（P均<0.05）。

2.2 EOC组织中miR-515-5p与CSPG4 mRNA表达的相关性 经TargetScan数据库7.2https：//www.targetscan.org/预测，miR-515-5p与CSPG4的3′-非翻译区210-216处存在结合位点（图1）。Pearson相关系数分析显示，EOC组织中miR-515-5p与CSPG4 mRNA表达呈负相关（r=-0.710，P<0.05）。

图1 miR-515-5p与CSPG4的结合位点图

2.3 miR-515-5p、CSPG4 mRNA表达与EOC病理特征的关系 miR-515-5p、CSPG4 mRNA表达与EOC分化程度、FIGO分期、淋巴结转移有关（P均<0.05）。见表1。

表1 EOC组织中miR-515-5p、CSPG4 mRNA表达与病理特征的关系

2.4 EOC组织中miR-515-5p、CSPG4 mRNA表达与预后的关系 84例EOC患者随访3～36个月，失访4例，死亡36例，3年累积生存率为57.14%（48/84）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，miR-515-5p高表达者（≥0.96，45例）累积生存率68.89%（31/45）高于低表达者（≥0.96，39例）的43.59%（17/39），两者比较差异有统计学意义（χ2=7.462，P<0.05）；CSPG4 mRNA高表达者（≥1.37，43例）累积生存率44.19%（19/43）低于低表达者（≥1.37，41例）的70.73%（29/41），两者比较差异有统计学意义（χ2=7.554，P<0.05）。

3 讨论

EOC是源于卵巢上皮细胞的恶性肿瘤，早期症状以腹部肿大、腹胀、腹痛和内分泌失调为主，但绝大多数患者症状隐匿，临床中超过70%的卵巢癌患者就诊时已处于临床晚期，已伴盆腔播散或淋巴结转移，手术治疗异常困难，即使多学科合作亦难以达到满意的癌细胞减灭效果，且术后多次化疗易反复复发，5年生存率仅40%［7］。尽管近年来随着基因检测的普及和靶向药物“多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂”的应用，EOC患者生存期得以有效延长，但仍有部分患者难以获得临床效益，且获得性耐药和不良反应随着治疗时间的延长愈发常见［8］。

EOC的发生、发展是一个复杂和多因素共同参与的过程，近年随着生命科学的快速发展，越来越多研究证实miRNA能通过引发信使核糖核酸的降解或转录后的基因沉默参与EOC发生、发展［9］。miR-515-5p定位于人染色体19q13.42，近年来大量研究报道与肿瘤有关。DING等［10］研究报道，miR-515-5p在结直肠癌中低表达，能靶向有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1抑制结直肠癌细胞增殖并诱导其凋亡。LIU等［11］研究报道，miR-515-5p在前列腺癌中低表达，能靶向解整合素金属蛋白酶10抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭。上述研究提示miR-515-5p可能是一种抑癌基因。本研究结果显示，EOC组织中miR-515-5p低表达，提示miR-515-5p低表达可能参与EOC发生，miR-515-5p在EOC组织中低表达可能与其启动子甲基化有关［12］。本研究结果显示，EOC组织中miR-515-5p表达与组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移和预后有关，进一步说明miR-515-5p低表达参与EOC发生发展，分析其机制可能与抑制白细胞介素-6（IL-6）表达有关。IL-6作为炎症核心分子，能结合其受体调节激活多条信号通路促进EOC恶性进展［13］。申利等［14］报道，上调miR-515-5p能靶向抑制IL-6，进而抑制EOC细胞增殖、迁移和侵袭。

EOC的发生发展伴随多条信号通路异常激活/失活，细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）是EOC最常改变的信号通路［15］。CSPG4定位于人染色体15q24.2，最初于黑色素瘤中发现，CSPG4高表达能激活ERK1/2信号通路促进黑色素瘤增殖、运动、侵袭和抗凋亡［16］。后续研究发现，CSPG4的细胞内结构域能连接肌动蛋白细胞骨架，还能激活PI3K/Akt/mTOR，促进黑色素瘤恶性进展［17］。近年研究亦证实，CSPG4高表达与胰腺癌、肝癌、胶质瘤、肾癌等肿瘤进展有关［18］。本研究结果显示，EOC组织中CSPG4 mRNA高表达，与组织分化程度、FIGO分期、淋巴结转移和预后有关，说明CSPG4 mRNA高表达参与EOC发生、发展，分析其机制与CSPG4升高能激活ERK1/2、PI3K/Akt/mTOR等信号通路，促进EOC细胞增殖、迁移和侵袭有关［17-18］。本研究通过网站预测发现，miR-515-5p与CSPG4的3′-非翻译区210～216处存在结合位点，二者在EOC中的表达呈负相关，提示二者可能共同参与EOC进展。江红等［19］研究报道，上调miR-515-5p能靶向下调CSPG4，抑制卵巢癌细胞增殖和转移。本研究分析EOC患者预后发现，miR-515-5p高表达和CSPG4 mRNA低表达的EOC患者3年累积生存率升高，说明miR-515-5p、CSPG4 mRNA表达与EOC患者预后有关，可能成为EOC患者预后评估标志物。

综上所述，EOC组织中miR-515-5p低表达和CSPG4 mRNA高表达与患者病理特征和预后相关，二者可能共同参与EOC进展，但本研究结果还需前瞻性多中心研究验证。