SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化在消化道肿瘤诊断和预后预测中价值的研究进展

单阳阳 张健锋 毛振彪

尽管在消化道肿瘤治疗方面的研究已取得了较大进展，但在全球范围内消化道肿瘤的病死率仍较高，结直肠癌（CRC）、胃癌、原发性肝癌的病死率分别为9.2%、8.2%、8.2%[1]。因此，应用非侵入性方法检测早期肿瘤标志物十分重要，而DNA 甲基化是被研究得较多的表观遗传修饰，DNA 甲基化水平和模式的改变，可以导致抑癌基因沉默，或原癌基因激活，进而增高肿瘤的发生风险。矮小同源盒基因2（SHOX2）和Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）基因是多种肿瘤信号通路的调节剂，已被证明可以促进肿瘤的发生和进展；SHOX2 和RASSF1A基因甲基化检测的敏感度较高，尤其在疾病早期阶段[2]。本文就SHOX2 和RASSF1A基因功能及其作用机制，以及DNA 甲基化修饰在消化道肿瘤诊断和预后预测中价值的研究进展作一综述。

1 SHOX2 和RASSF1A 基因功能及其作用机制

1.1 SHOX2 基因

SHOX2 是一种促癌基因，其是细胞增殖、凋亡的调节剂及上皮-间质转化（EMT）的诱导剂，除了促进肿瘤进展的作用外，SHOX2 在骨骼发育、胚胎发育和心血管系统分化中也起着重要的促进作用[3]。SHOX2 同源基因位于3 号染色体上，其CpG 岛高甲基化频发，并在肺癌、乳腺癌、食管鳞状细胞癌（ESCC）和肝细胞癌（HCC）等肿瘤组织和细胞中表达升高[4]。研究发现，在早期非小细胞肺癌患者中，SHOX2 基因启动子甲基化与不良预后相关，其通过下游靶基因促进肿瘤的发生、EMT 和骨转移，并与耐药有关[5]。在乳腺癌细胞中，SHOX2 是EMT 的新型诱导因子，其表达水平与乳腺癌患者的生存率密切相关；SHOX2 可在转录水平直接激活促转移基因WASF3 的表达，导致肿瘤转移潜能显著增强，并将信号转导和转录激活因子3（STAT3）招募至WASF3 基因启动子，STAT3与SHOX2 形成功能性免疫复合物，增强了乳腺癌细胞中WASF3 的转录活性，这提示SHOX2/STAT3/WASF3 信号通路可能可以促进肿瘤转移[6]。此外，SHOX2 还能通过上调Runt 相关转录因子2（RUNX2）的表达以抑制抑癌基因p53 的活性，导致肿瘤发生[7]。

1.2 RASSF1A 基因

RASSF1A是被研究得较为深入的抑癌基因，在机体正常组织中广泛表达，能调节细胞周期、参与细胞凋亡和稳定微管，并参与生长调节；此外，RASSF1A还参与肿瘤的发生和转移，其编码的支架蛋白能通过正反馈或负反馈机制调节复杂信号网络中的信号转导[8]。RASSF1A位于3p21.3 染色体区域，对多种肿瘤的遗传和表观遗传变化敏感，可调节多条肿瘤相关信号通路并干扰多种细胞过程。在多种肿瘤（如乳腺癌、肺癌、胃肠道肿瘤、前列腺癌等）中均能检测到异常的RASSF1A基因甲基化[9]。RASSF1A还与肿瘤的淋巴结转移、血管侵犯及化学治疗药物耐药有关。肿瘤组织中RASSF1A 缺乏的主要原因是RASSF1A等位基因杂合缺失和启动子中CpG 岛超甲基化而失活，DNA甲基转移酶（DNMT）能介导该类CpG 岛甲基化，因此肿瘤细胞中DNMT 活性增强可导致RASSF1A基因高甲基化，进而使蛋白质表达降低。研究表明，RASSF1A 的Sarah 结构域可使RASSF1A 与RASSF异构体结合以形成同源二聚体或异源二聚体，并与巯基丙酮酸硫转移酶（MST）蛋白的Sarah 结构域相互作用，以激活Hippo 信号通路，该通路是重要的促凋亡信号通路[10]。Schmidt 等[11]的研究发现，RASSF1A 敲除细胞中IL-6 表达升高且炎性反应增强，IL-6 可通过上调肿瘤细胞中的DNMT1 表达以促进RASSF1A基因高甲基化并抑制RASSF1A转录。可见，RASSF1A甲基化和促炎性细胞因子表达升高在肿瘤发生和转移中有协同作用。

2 SHOX2 基因甲基化在消化道肿瘤中的作用

2.1 SHOX2 基因与食管癌

ESCC 是中国较常见的食管癌病理分型，由于该肿瘤的早期侵袭性、易发生淋巴结和器官转移导致治疗效果不佳，患者的预后较差。实时荧光定量PCR 结果显示，SHOX2 在ESCC 组织和细胞中表达上调，是EMT 的调节因子，在体内外均能诱导ESCC 细胞增殖、侵袭和转移；当miR-375 过表达时，SHOX2 表达降低，ESCC 细胞的增殖、侵袭和转移能力减弱，这提示SHOX2 是ESCC 的促癌基因，miR-375 可通过抑制SHOX2 的表达以抑制EMT[12]。因此，miR-375/SHOX2 信号通路可能是治疗ESCC 的新靶点。

2.2 SHOX2 基因与胃癌

临床研究表明，SHOX2 表达升高与胃癌患者总生存率较低显著相关，是影响胃癌患者预后的因素；该研究还发现，长链非编码RNA（lncRNA）IGF2-AS 在胃腺癌（GAC）中起着重要的调控作用，作为miR-503 的竞争性内源RNA，其可上调SHOX2的表达，与GAC 患者预后不良有关[13]。研究显示，与正常组织相比，GAC 组织中SHOX2 表达升高，尤其在小鼠感染幽门螺杆菌（Hp）后，SHOX2转录水平显著升高，这提示SHOX2 基因甲基化与GAC 的发生、发展有关[14]。SHOX2 基因是否可作为GAC 患者的预后预测标志物，尚待进一步研究。

2.3 SHOX2 基因与CRC

循环游离DNA（cfDNA）中的SHOX2 和胞裂蛋白9（SEPT9）基因甲基化是CRC 筛查、诊断和分期的生物标志物。结肠腺瘤和CRC 组织中SHOX2 基因甲基化水平显著高于正常组织；SEPT9或SHOX2 基因甲基化检测可能有助于区分CRC 或结肠腺瘤与正常或炎性结肠组织，并可区分晚期腺瘤与非晚期腺瘤，该结论还需进一步的研究验证[15]。Bergheim 等[16]的研究检测了184 例CRC 患者术前和术后3～10 d 的ccfDNA 甲基化水平，结果 显 示 治 疗 前ccfDNA 中SHOX2 和SEPT9 基 因甲基化水平与国际癌症控制联盟（UICC）分期、TNM 分期、组织学分级，以及淋巴浸润和囊外淋巴结扩散密切相关，治疗后SHOX2 和SEPT9 基因甲基化水平与UICC 分期相关；ccfDNA 中SHOX2基因甲基化水平与UICC 分期（Ⅰ～Ⅳ）、淋巴结分期（N0～N2）、组织学分级（G1～G3）和淋巴浸润（L0～L1）程度均呈正相关，这有助于TNM 分期的诊断及个体化治疗方案的制定。此外，SHOX2与CRC 的发生、发展有关。Yang 等[17]的研究发现，SHOX2 能 通 过 调 节lncRNA SNHG11/miR-339-3p 信号通路促使CRC 进展；敲低SHOX2 可抑制CRC 细胞的增殖、迁移和侵袭；这提示SNHG11/miR-339-3p/SHOX2 信号通路是CRC 发生、发展的重要调控机制。

3 RASSF1A 基因甲基化在消化道肿瘤中的作用

3.1 RASSF1A 基因与胃癌

多数胃癌患者确诊时已为晚期，可选择的治疗方案有限。胃癌的发病机制涉及多种遗传和表观遗传改变，胃癌组织中RASSF1A基因甲基化水平较正常胃组织显著升高[18]。Karamitrousis 等[19]研究了105 例出现转移的胃癌患者和20 名健康对照者的血液样本，结果发现其中68 例患者存在RASSF1A基因启动子甲基化，而健康对照者无RASSF1A基因启动子甲基化；此外，在46例疾病进展患者中，有35 例存在RASSF1A基因启动子甲基化，提示RASSF1A基因启动子甲基化与治疗效果相关。多种基因的表观遗传修饰是胃癌进展的关键因素。Karamitrousis 等[20]的研究评估了70例 晚 期 胃 癌 患 者ccfDNA 中RASSF1A、SOX17 和WIF-1 的甲基化状态，发现在出现转移的胃癌患者中，抑癌基因RASSF1A甲基化最为常见，其余依次为SOX17 和WIF-1；与无甲基化的患者相比，RASSF1A基因启动子甲基化的患者的无进展生存期和总生存期均较短。由于该研究的样本量较小，未来需进一步研究以揭示RASSF1A等基因甲基化是否可作为预测胃癌患者预后的生物标志物。

3.2 RASSF1A 基因与CRC

RASSF1A基因高甲基化与CRC 患者的总生存期较短和预后不良有关[21]。80%～90%的CRC 是由腺瘤性息肉和结直肠侧向发育型肿瘤（LST）发展而来，有研究发现，LST 患者的RASSF1A基因甲基化水平介于腺瘤性息肉与CRC 之间，提示其可能可以早期诊断CRC[22]。此外，CRC 患者的生存率、肿瘤转移和肿瘤分化均与RASSF1A基因启动子甲基化水平有关[23]。Hu 等[21]的荟萃分析结果显示，RASSF1A基因甲基化与较高的CRC 发病风险和较短的总生存期有关，这提示RASSF1A是预测CRC 发病风险和预后的生物标志物。Blanchard等[24]的研究发现，在包括结肠癌在内的多种肿瘤中，抑癌基因叉头框转录因子M1（FOXM1）会导致抑癌基因RASSF1A表达升高，这有助于开发晚期CRC 的药物联合治疗方案。研究发现，MGMT、RASSF1A与SEPT9 基因启动子甲基化联合检测诊断CRC 的敏感度、特异度、阳性预测值和ROC 曲线下面积（AUC）分别为96.6%、74.0%、91.5%和0.97，其诊断效能优于表观遗传学生物标志物（NGFR/SEPT9/TMEFF2，SFRP2/RASSF）[25]。今 后尚需评估体液（尤其是血液）中MGMT、RASSF1A和SEPT9 基因启动子甲基化联合检测的诊断效能，以开发可应用于临床的检测方法。

3.3 RASSF1A 基因与HCC

RASSF1A基因异常甲基化是诊断HCC 的潜在生物标志物，甲胎蛋白（AFP）诊断HCC 的特异度较高，但敏感度仅为47%[26]。一项荟萃分析结果显示，RASSF1A基因甲基化与AFP 联合检测可提高HCC 的诊断率。研究发现，HBV 介导HCC 发生的表观遗传基础是HBV 编码的X 蛋白通过上调DNMT1 诱导RASSF1A基因启动子甲基化，抑制RASSF1A表 达[27]。在 诊 断HBV 相 关HCC 时，相较于AFP 检测，血清RASSF1A基因甲基化检测的敏感度和特异度较高[28]。因此，AFP 与RASSF1A基因甲基化联合检测可有效鉴别HCC 与慢性乙型肝炎（CHB），也可预测HCC 的进展和预后[23]。Kim 等[29]应用AFP 与尿ccfDNA（TP5 基因突变、RASSF1A基因甲基化和GSTP1 基因甲基化）联合检测方法，在186例HCC 患者中检出148 例，诊断的敏感度和特异度分别为79.6%和90%；与AFP单独检测相比，联合检测检出的病例数增加了30%，并且提高了早期HCC 的检出率。因此，AFP与尿ccfDNA 联合检测对HCC 的诊断效能较好，尤其是对AFP 未显著升高的HCC 患者，该检测有潜力作为非侵入性HCC 筛查方法。

3.4 RASSF1A 基因与胰腺癌

胰腺癌的病死率较高，美国胰腺癌患者的5年生存率约为10%[30]。尽管在胰腺癌的诊断和治疗方面已取得重大进展，但早期诊断仍较为困难，多数患者确诊时已处于晚期，预后较差。胰腺癌的易感性与基因突变和表观遗传修饰相关[31]。Asano等[32]对33 例胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN）患者的手术切除标本的46 个解剖区域进行了分析，发现RASSF1A基因甲基化在潜在恶性区域较良性区域多见，这提示RASSF1A基因高甲基化与IPMN进展、恶变及较差的预后有关。此外，Henriksen 等[33]的研究纳入了346例胰腺导管腺癌（PDAC）Ⅰ～Ⅳ期患者和25 例慢性胰腺炎患者，该研究对血清cfDNA 样本进行了包含RASSF1A在内的多种基因甲基化的特异性PCR 检测，并与血清CA19-9 联合检测，结果显示PDAC 患者血清cfDNA 的高甲基化基因数量多于慢性胰腺炎患者；此外，该研究中基因甲基化与血清CA19-9 联合检测诊断PDAC的AUC 为0.93，大于血清CA19-9 单独检测，提示其有潜力作为诊断PDAC 的生物标志物，并有助于鉴别PDAC 和慢性胰腺炎。

4 总结

SHOX2 和RASSF1A基因在消化道肿瘤的发生、发展、转移及耐药中均起着重要作用，这2 种基因甲基化检测分别与其他指标联合检测被认为是较好的消化道肿瘤筛查和监测方法，具有较高的敏感度和特异度。在消化道肿瘤患者体内，SHOX2表达升高，而RASSF1A表达则降低，两者的甲基化水平均明显升高[34]。研究表明，当SHOX2 和RASSF1A与其他异常甲基化基因联合检测时，其特异度和敏感度显著升高。需要注意的是，仅应用基因甲基化检测结果指导临床实践的可靠性不高，需与常规检测方法联合应用。综上所述，SHOX2和RASSF1A基因有潜力作为早期消化道肿瘤诊断和预后预测的生物标志物，也可作为肿瘤治疗中表观遗传调控的靶标。DNA 甲基化检测的敏感度较高且较为客观，其与液基脱落细胞学检查联合应用可以弥补细胞学检查敏感度较低的缺点。DNA 甲基化检测也可以作为组织细胞形态学检查的辅助诊断工具。