反式肉桂酸电喷雾质谱负离子模式脱CO的路径

方芳，方舟，孙长海

（1.佳木斯大学临床医学院,黑龙江佳木斯 154003；2.佳木斯大学药学院, 黑龙江佳木斯 154007）

反式肉桂酸俗称桂皮酸、是天然芳香不饱和羧酸,其化学结构为反式苯丙烯酸。作为植物中生物合成关键的化学物质,其苯环上的羟基、甲氧基取代及其衍生物组成了系列的植物芳酸,呈现出广泛的生理活性[1-4]。肉桂酸自身也具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗癌和保护神经的作用,正引起人们的关注[5-7]。质谱作为分析化学的重要技术,现已成为天然产物研究的常规分析手段[8-9]。质谱分析中量子化学的引入,使人们对化合物质谱裂解机理的认识得以加深,同时也丰富了气相反应化学的理论与实践的内容。量子计算已应用于化合物质谱碎裂机制与质谱的预测研究[10-13],其中尤以密度泛函理论（DFT）与方法的使用最为广泛[14-15]。在肉桂酸的研究中,已见其及其衍生物的化学结构、分子构象和振动的量子化学研究[16-19]。另外,肉桂酸的取代产物酚羟基肉桂酸的裂解特征也已运用DFT 计算进行过探索[20]。

反式肉桂酸于电喷雾电离的负离子模式下的质谱较为简单,去质子分子裂解通常仅呈现脱羧产物离子碎片,当加大质谱碰撞能量时会有脱CO 产物离子碎片出现。虽然当前的质谱数据库中反式肉桂酸的质谱收录较为丰富,但反式肉桂酸的质谱裂解机制却鲜见报道。从理论上揭示反式肉桂酸质谱裂解的机制,不仅有助于深入理解其质谱特征,并且能为相关的植物芳酸质谱研究提供基础的理论支持。笔者利用DFT 方法计算电喷雾负离子模式下的反式肉桂酸负离子质谱裂解脱CO 最有可能的路径,并揭示其质谱中脱CO产物离子丰度较弱的原因。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

四级杆-轨道阱高分辨质谱仪：Thermo ScientificTM Q-ExactiveTM 组合型,美国赛默飞世尔科技有限公司。

TMO-NM-35C氮气发生器：英国PerMuta科技有限公司。

反式肉桂酸对照品：成都瑞芬思生物科技有限公司。甲醇：色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司。高纯氮气：质量分数为99.999%,哈尔滨黎明气体有限公司。

氮气：纯度为99.9%,由氮气发生器制备。

反式肉桂酸甲醇溶液：1 μg/mL,准确称取反式肉桂酸对照品适量,用甲醇溶解、稀释并定容。

1.2 质谱条件

鞘气：氮气,压力为275.8 kPa,流量为5 L/h；辅助气体：氮气,压力为137.9 kPa,流量为5 L/h；吹扫气：氮气,压力为68.95 kPa；毛细管电压：3 kV；离子传输管温度：320 ℃；辅助气体加热温度：350 ℃；内源能量：0～100 eV；碰撞气体：高纯氮气；高能碰撞裂解（HCD）碰撞池的归一化碰撞能量：10～200 eV；一级质谱分辨率为70 000；二级质谱分辨率为17 500；离子扫描范围：m/z50～200；循环记录次数：3 次；四级杆隔离窗：m/z3；动态排除时间5 s。

1.3 实验步骤

取1 μg/mL 反式肉桂酸甲醇溶液,通过注射泵注入ESI 源,注射流量为15 μL/min,按设定的质谱条件测定,获取质荷比为60～160的质谱。

1.4 计算与分析

全部的理论计算通过高斯09 软件完成[21]。结构优化和频率计算通过密度泛函理论RB3LYP方法在6-311G 基组水平进行,轻、重原子均加极化函数与弥散函数。以结构几何优化后结构振动频率计算结果无虚频为标准,确定前体离子、中间物质和产物离子的结构,以仅有单一的振动虚频同时具有合理的振动模式为标准判定过渡态结构,并要求其能够通过内禀反应坐标（IRC）计算分别连接前体离子及产物离子[22-23]。能量计算时采用电子与吉布斯自由能总和,能量单位为kJ /mol。

2 结果与讨论

2.1 质谱图

反式肉桂酸去质子分子HCD 能量为120 eV 下的二级质谱如图1。质荷比147.05的离子为反式肉桂酸的去质子分子离子,质荷比103.06 与119.05 的粒子为碎片离子。两碎片离子分别为去质子分子脱羧产物离子与脱CO产物离子。

图1 反式肉桂酸去质子分子的二级质谱图

2.2 CO脱除的途径

在负离子质谱模式条件下,反式肉桂酸分子位于侧链上的羧基解离出质子产生去质子分子,理论计算模拟可得到两条脱除CO的途径。这两条路径的起始均由去质子分子的负离子而引发,终点生成了同一脱CO产物苯乙酮负离子,两条脱除CO的途径所涉及的各中间产物与相应的过渡态数目也相等。

图2为脱CO的第一条路径。从中可知,首先反式肉桂酸去质子分子M0羧基上带有负电的氧经过渡态TS1与苄基碳结合,形成四元内脂环的中间产物M1。接着M1内脂环上苄基位上的氢经过渡态TS2、中间产物M2与过渡态TS3,在内脂环中连续两次发生1→2质子迁移,内脂环开裂生成具有β-羟基肉桂醛负离子结构的中间产物M3。尔后,M3醛基上的氢也发生1→2质子迁移,从而促使醛基碳与其相邻碳间的键发生断裂,脱去CO 生成产物苯乙酮负离子P。

图2 反式肉桂酸脱CO路径1

图3 为第一条路径中过渡态、中间产物与产物相对于去质子分子的能线图。所涉及的3个中间产物,相对能量由低到高的顺序依次为M3、M1、M2。结合图2中相应结构可知,能量顺序原因：M3结构上苯环侧链呈直链型,而M1与M2的侧链均为张力较大的四元环；另外,同为四元内脂环的M1与M2,由于M1的负电位于羰基的α碳上,故较M2相对稳定。路径1中4个过渡态相对于M0的能量以TS1为最小,后3 个过渡态均为质子的1→2迁移,有趣的是所对应的能量基本接近。整条路径所需最大能量为356 kJ /mol。

图3 反式肉桂酸脱CO途径1势能图

图4 与图5 分别是第二条脱CO 的路径及其能线图。图4 显示第二条路径过程：初始时去质子分子M0苄基碳上的氢发生1→4 质子迁移,经过渡态TS5与羧基负氧离子结合产生首个中间产物M4。随后,M4形成的羟基经过渡态TS6进行旋转、生成下一中间产物M5。接下,M5的羟基经过渡态TS7转移到苄基碳上,形成中间产物M6。最后,M6转移来的羟基上的氢经过渡态TS8进行1→3 质子迁移、与侧链羟基邻位碳结合,进而引发碳—碳键断裂脱去中性分子CO,生成产物苯乙酮负离子P。

图4 反式肉桂酸脱CO路径2

图5 反式肉桂酸脱CO途径2势能图

图5显示,路径2中的3个中间产物的相对能量顺序由低到高依次为M4、M5、M6,其中M4与M5的能量较为接近。结合图4 中的结构可知,其原因在于M4与M5的负电荷位于苄基碳上相对较容易分散,而M6的负电荷较集中在羰基碳上,使得M6的结构较不稳定,从而使得M6的能量较高；路径2 中所涉及的4个过渡态,以首个过渡态TS5的能垒最小。这是由于去质子分子M0中负电荷在羧基氧上较为集中,使得氢容易与其结合,同时1→4 质子迁移过渡态的结构为一五元环,而第三个过渡态TS7的羟基转移及第四个过渡态TS8的1→3质子迁移时的均为四元环,TS5的五元环环张力相对小些。第二个过渡态的能量也较低,其原因在于这一过渡态为键的旋转,所需能量相对较小。整条路径所需最大能量为410 kJ/mol。

比较脱CO的路径可知,虽然路径2首个过渡态较路径1 的首个过渡态的能垒低113 kJ/mol,路径2的键旋转的第二个过渡态的能垒也低于路径1的首个过渡态,但第三个过渡态TS7涉及羟基向带有负电荷的碳转移,要克服一定的排斥力需要能量较多,使得路径1较路径2的CO的脱除更容易完成,所需最大能量较路径2 小54 kJ/mol。鉴于两条脱CO 的产物相同,路径的优势取决于动力学,因此路径1更为可能。

2.3 脱除CO产物丰度

由上述结果可知,在电喷雾负离子模式下反式肉桂酸于质谱中,只要获取356 kJ/mol的能量,即可完成脱CO 产生质荷比为119 离子碎片。从图1 可见,在实验条件下,反式肉桂酸于质谱脱除CO产物的丰度远远低于脱除CO2产物的丰度。理论计算表明反式肉桂酸质谱脱羧最可能的途径为C—C键异裂无过渡态的直接脱羧,相应的键断裂能为172 kJ/mol,脱羧产物可经230 kJ/mol能垒的过渡态转化成更稳定的苯乙烯负离子；脱羧及产物转化涉及的能量远远小于脱CO需要的能量。

3 结语

量子化学计算表明,于电喷雾负离子模式下,反式肉桂酸质谱裂解脱除中性分子CO的产物为苯乙酮离子。其最可能的脱除CO的机制为由反式肉桂酸去质子分子中氧与苄基碳成键而引发,历经四元内脂环成环、内脂环环内质子迁移、内脂环脂键开裂,醛基氢转移与醛基C—C断裂等过程。脱CO的路径由4个过渡态与3个中间产物组成,脱除中性分子CO 所需能量为356 kJ/mol。反式肉桂酸质谱裂解过程中,脱除CO2的能量接近于脱CO能量的1/2,在动力学具有较大的优势。由此,使得反式肉桂酸质谱脱CO 的产物离子相应的丰度极低,脱羧的产物离子表现为基峰。