顶空气相色谱法测定吡仑帕奈中5种有机溶剂

2023-08-08顾晓风唐倩倩

化学分析计量 2023年7期

顾晓风，唐倩倩

（1.苏州市药品检验检测研究中心,江苏苏州 215104；2.山东绿叶制药有限公司,山东烟台 264670）

吡仑帕奈由日本卫材公司研发,是目前唯一一个口服速效的高选择性和非竞争性的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体拮抗剂[1‒2],通过直接减弱兴奋性递质谷氨酸引起的神经毒性,抑制癫痫发作[3]。作为第三代口服抗癫痫药,对于难治性癫痫,尤其是癫痫持续状态,在其它抗癫痫药控制不佳时,吡仑帕奈作为辅助治疗可获得良好的疗效[4‒7],其制剂于2012年在美国上市,2019年12月在国内上市。

吡仑帕奈原料药在其合成过程中,使用了乙酸乙酯、四氢呋喃、吡啶和N,N-二甲基甲酰胺4 种溶剂,在最终产物的后处理中,使用了大量甲醇进行洗涤[8]。药物中残留的有机溶剂是否得到合理有效的控制,直接关系到药品的质量可控性与安全性[9‒10]。经文献查阅,尚未见吡仑帕奈原料药中有机溶剂残留量测定的报道。根据人用药品注册技术要求国际协调会(The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use,ICH)和《中华人民共和国药典》2020 年版四部附录0861的相关规定,笔者采用顶空气相色谱法[11‒16],对吡仑帕奈原料药中5种有机溶剂的残留量进行测定,以确保药品的安全、有效和质量可控。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：7890B 型,安捷伦科技(中国)有限公司。

顶空进样器：7697 A型,安捷伦科技(中国)有限公司。

电子天平：XS205DU型,感量为0.1 mg,瑞士梅特勒–托利多公司。

氮气：纯度为99.999%、苏州金宏气体股份有限公司。

吡仑帕奈原料药样品：批号为117H0901,某药厂提供。

二甲基亚砜：色谱纯,德国默克公司。

乙酸乙酯、四氢呋喃、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺和甲醇：分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent DB-624 石英毛细管柱(30 m×0.32 mm,1.8 μm,美国安捷伦科技有限公司)；柱温：程序升温,起始温度为40 ℃,保持4 min,以20 ℃/min 的速率升至200 ℃,保持4 min；进样口温度：250 ℃；检测器：氢火焰离子化检测器(FID),温度为250 ℃；载气：氮气,流量为2 mL/min；顶空平衡温度：100 ℃；平衡时间：20 min；进样时间：0.5 min。

1.3 溶液配制

5种溶剂混合对照品储备液：精密称取甲醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、吡啶、N,N-二甲基甲酰胺适量,加入二甲基亚砜溶解并稀释成质量浓度分别为3.02、5.00、0.72、0.18、0.92 mg/mL的混合溶液。

5 种溶剂混合对照品溶液：精密移取混合对照品储备液1 mL,置于50 mL 量瓶中,加二甲基亚砜稀释至标线,摇匀,精密移取5 mL置于顶空瓶中,加盖密封,即得。

吡仑帕奈原料药样品溶液：精密称取吡仑帕奈原料药样品0.1 g,置于顶空瓶中,精密加入二甲基亚砜5 mL,加盖密封,超声(500 W,40 kHz)处理2 min使之溶解,即得。

空白溶液：精密移取二甲基亚砜5 mL,置于顶空瓶中,加盖密封,即得。

1.4 实验方法

取5种溶剂混合对照品溶液和吡仑帕奈原料药样品溶液,按1.2色谱条件进样分析,记录色谱峰面积,以外标法计算得到样品中5 种有机溶剂的残留量。

2 结果与讨论

2.1 溶剂的选择

由于目标物N,N-二甲基甲酰胺沸点较高,分别选择N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜作为溶剂进行考察。经试验,吡仑帕奈在二甲基亚砜中易溶,而在N,N-二甲基乙酰胺中不易分散均匀。进一步考察不同浓度的二甲基亚砜水溶液对目标物色谱行为的影响,结果表明当增加二甲基亚砜水溶液中水的体积分数时,甲醇、乙酸乙酯、四氢呋喃和吡啶色谱峰面积增大,而N,N-二甲基甲酰胺色谱峰面积减小,灵敏度降低。由于N,N-二甲基甲酰胺在该色谱系统中峰面积本身较小,故优先考虑N,N-二甲基甲酰胺的检测灵敏度,最终选择以二甲基亚砜为溶剂。

2.2 顶空条件的选择

设定顶空平衡温度分别为80、90、100、110、120 ℃,结果表明：随着温度的升高,各目标物色谱峰面积均增大,当温度为110 ℃及以上时,基线噪音明显增大,故最终选择顶空平衡温度为100 ℃。

设置顶空温度为100 ℃,分别设置顶空平衡时间为20、30、40 min,考察目标物的色谱行为,结果表明无明显差异,考虑分析效率,选择20 min 作为顶空平衡时间。

2.3 色谱条件的选择

根据5 种目标有机溶剂的极性,选择弱极性及中等极性的色谱柱进行分离。分别考察HP-5、DB-17 及DB-624 色谱柱,结果表明,DB-624 色谱柱分离效果最好。另考察规格不同的DB-624 毛细管柱,规格为30 m×0.32 mm,1.8 μm (流量设为2 mL/min)和规格为30 m×0.53 mm,3 μm (流量设为5 mL/min),均能满足分析要求。笔者选择规格为30 m×0.53 mm,3 μm的DB-624毛细管柱。

取1.3制备的空白溶液、5种试剂混合对照品溶液和吡仑帕奈原料药样品溶液,按1.2色谱条件进行测定,色谱图见图1～图3。由图1～图3可知,空白溶液及吡仑帕奈原料药样品溶液中其它杂质对目标物无干扰,5种试剂混合对照品溶液中,各色谱峰之间的分离度均大于2.0,满足分析要求。

图1 空白溶液色谱图

图2 5种溶剂混合对照品溶液色谱图

图3 吡仑帕奈原料药样品溶液色谱图

2.4 线性关系、定量限与检出限

精密量取5种溶剂混合对照品储备液4、2、0.5、0.1、0.02 mL,分别置于100 mL 容量瓶中,加入二甲基亚砜稀释至标线,摇匀,配制成乙酸乙酯质量浓度分别为200.08、100.04、25.01、5.00、1.00 μg/mL 的系列标准工作溶液；另精密量取5 种溶剂混合对照品储备液4、2、1、0.2、0.05 mL,分别置于100 mL 容量瓶中,加入二甲基亚砜稀释至标线,摇匀,作为甲醇、四氢呋喃的系列标准工作溶液,甲醇的质量浓度分别为120.78、60.39、30.20、6.04、1.51 μg/mL,四氢呋喃的质量浓度分别为28.94、14.47、7.23、1.45、0.36 μg/mL；另精密量取5 种溶剂混合对照品储备液4、2、1、0.5、0.2 mL,分别置于100 mL 容量瓶中,加入二甲基亚砜稀释至标线,摇匀,作为吡啶和N,N-二甲基甲酰胺的系列标准工作溶液,吡啶的质量浓度分别为7.37、3.69、1.84、0.92、0.37 μg/mL,N,N-二甲基甲酰胺的质量浓度分别为36.66、18.33、9.17、4.58、1.83 μg/mL。精密量取上述溶液各5 mL,置于顶空瓶中,密封,进样测定,记录色谱峰面积,以各目标物标准工作溶液的质量浓度x(μg/mL)为横坐标,对应色谱峰面积y为纵坐标,绘制标准曲线。

取5 种溶剂混合对照品储备液,用二甲基亚砜逐级稀释,测定并记录色谱峰面积,以信噪比为10∶1对应的溶液质量浓度作为定量限,以信噪比为3∶1对应的溶液质量浓度作为方法检出限。

5 种溶剂的线性范围、线性方程、相关系数、定量限和检出限见表1。

表1 5种溶剂的线性范围、线性方程、相关系数、定量限和检出限

2.5 加标回收试验

分别精密移取5种溶剂混合对照品储备液1、2、3 mL,置于100 mL容量瓶中,加入二甲基亚砜稀释至标线,摇匀,得到低、中、高三个浓度水平的5种溶剂混合对照品溶液。精密称取吡仑帕奈原料药样品(批号117H0901)9 份,每份0.1 g,分别置于顶空瓶中,每3份为1组。将3组分别精密加入上述5种溶剂混合对照品溶液各5 mL,加盖密封,超声(500 W,40 kHz)处理2 min使样品溶解,按1.2色谱条件进行检测,计算平均回收率,结果见表2。