超高效液相色谱-串联质谱法测定烟用水基胶中14种杀菌剂

夏志骋，钟杰，谢剑晨，黄灵洁，曹昌清，王颖

（上海烟草集团有限责任公司质量监督检测站,上海 200082）

为了防止烟用水基胶生产加工和贮藏过程中发生霉变,通常会使用杀菌剂。杀菌剂对细菌、霉菌、藻类等具有很强的抑制和杀灭作用,是防止水基胶腐败变质最经济、最有效和最简洁的方法之一。烟用水基胶中常用的杀菌剂有异噻唑啉酮、山梨酸及苯甲酸以及部分含卤素的杀菌剂。

异噻唑啉酮类杀菌剂是通过断开细菌的藻类蛋白质的键而起作用,是最有效的杀菌剂之一。但异噻唑啉酮类杀菌剂具有一定生物毒性,过量使用容易造成肝肾损伤,具且有一定致癌性。为了保证烟用产品的质量安全,行业在2020年1月发布YQ 5—2019《烟用胶黏剂安全卫生要求》,对异噻唑啉酮类杀菌剂进行了明确限量[1]。异噻唑啉酮测定方法目前有液相色谱法[2-3]、气相色谱-质谱法[4]、液相色谱-串联质谱法[5-8]。

2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇（溴硝醇）,是一种广泛高效的抗菌剂,对细菌的抑制效果好,且不受阴离子、阴离子表面活性剂以及蛋白质的影响,属于中等毒性化合物。在YQ 5—2019《烟用材料许可使用物质名单》中,对溴硝醇含量有严格的限制。目前溴硝醇检测方法集中在化妆品及造纸领域[9-10]。

苯甲酸及苯甲酸盐类、山梨酸及山梨酸盐类这两类物质主要通过抑制微生物体内的脱氢酶系统,从而达到抑制微生物和起到防腐的作用。这两类防腐剂在各类食品中被广泛使用。GB 2760—2014《食品安全国家标准》规定苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐在饮料、酱油、醋及果酒中的含量应不大于1.0 g/kg,在《YQ15-烟用材料许可使用物质名单》中暂无对这两种物质的限量要求,但监控其使用情况对于保证人们身体健康具有重要意义。

在非YQ15 许可防腐剂中,尼泊金酯类也是广泛应用于各种食品和化妆品的杀菌防腐剂,主要破坏微生物的细胞膜,使细胞内的蛋白质变性,并能抑制细胞的呼吸酶活性,达到杀菌防腐的效果。此类杀菌防腐剂在部分欧洲搭口胶配方专用。

文献报道杀菌剂中溴硝醇、苯甲酸及苯甲酸盐类、山梨酸及山梨酸盐类[11]、尼泊金酯[12-16]的主要测定方法有液相色谱法、气相色谱法、高效液相-串联质谱法、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法[17]等方法。相关检测方法大都用于食品、造纸、化妆品行业,且仅检测其中一种或几种杀菌剂。相较于常规的液相色谱、气相色谱-质谱法,超高效液相-串联质谱法因具有良好定性、定量分析性能而成为同时测定杀菌剂的最佳方法。笔者建立一种样品预处理方法,并利用超高效液相-串联质谱法对烟用水基胶中溴硝醇、尼泊金酯、异噻唑啉酮、苯甲酸及苯甲酸盐类、山梨酸及山梨酸盐类进行快速、准确、同时检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：ACQUITY UPLC 型超高效液相色谱仪及Xevo TQ-XS 型串联四级杆质谱仪,美国沃特世公司。

超声波发生器：Sono Swiss SW 45H 型,瑞士Sono公司。

高速离心机：RJ-LDL-50G型,无锡市瑞江分析仪器有限公司。

电子天平：XP205型,感量为0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多有限公司。

尼泊金甲酯（MP）、尼泊金乙酯（EP）、尼泊金丙酯（PP）、尼泊金丁酯（BP）：质量分数均为99.0%,美国Accustandard公司。

尼泊金异丙酯（IPP）、尼泊金异丁酯（IBP）、山梨酸（SA）：质量分数均为99.0%,日本梯希爱公司。

2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇（溴硝醇,Bronopol,质量分数为99.4%）、苯甲酸（BA,质量分数为99.6%）、2-甲基-4-异噻唑啉-3酮（MI,质量分数为98.6%）、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI,质量分数为99.0%）、1,2-苯并异噻唑-3-酮（BIT,质量分数为99.0%）、2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（OIT,质量分数为98.9%）,德国Dr.E公司。

4,5-二氯-N-辛基-4-异噻唑啉-3-酮（DCOIT）：质量分数为98.0%,德国CNW公司。

BA-d5（质量分数为99.5%）、MP-13C6（质量分数为99.0%）、EP-13C6（质量分数为99.0%）、PP-d4（质量分数为99.0%）、MI-d3（质量分数为98.0%）,CMI-d3（质量分数为98.0%）、BIT-13C6（质量分数为98.0%）内标物：加拿大TRC公司。

甲醇：LC-MS级,德国默克公司。

实验室用水由Milli-Q 超纯水净化处理系统制备,符合一级水要求。

1.2 标准溶液的配制

混合标准储备液：分别称取6种尼泊金酯（MP、EP、IPP、PP、BP、IBP）、BA、SA、Bronopol、5 种异噻唑啉酮（MI、CMI、BIT、OIT、DCOIT）标准品适量,用甲醇溶解并稀释成BA、SA 质量浓度均为10 μg/mL,Bronopol、MI、BIT 质量浓度均为1 000 ng/mL,6 种尼泊金酯、CMI、OIT、DCOIT 质量浓度均为100 ng/mL的混合标准储备液。

混合标准工作溶液：用甲醇将BA、SA配制成质量浓度分别为25、50、100、250、500、1 000 ng/mL,Bronopol、MI、BIT 配制成质量浓度分别为2.5、5、10、25、50、100 ng/mL,6 种尼泊金酯、CMI、OIT、DCOIT 配制成质量浓度分别为0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL 的混合标准工作溶液（其中内标BA-d5质量浓度为100 ng/mL,MI-d3、CMI-d3、BIT-13C6质量浓度为10 ng/mL,MP-13C6、EP-13C6、PP-d4质量浓度为1 ng/mL）。

混合内标储备液：分别称取BA-d5、MP-13C6、EP-13C6、PP-d4、MI-d3,CMI-d3、BIT-13C6内标物适量,用甲醇溶解并稀释成BA-d5质量浓度为1 000 ng/mL,MI-d3、CMI-d3、BIT-13C6质 量 浓 度 为100 ng/mL,MP-13C6、EP-13C6、PP-d4质 量 浓 度 为10 ng/mL的混合内标储备液。

1.3 样品预处理

称取烟用水基胶约0.3 g于50 mL离心管中,用5 mL 水分散后再加入20 mL 甲醇,超声萃取10 min,将50 mL离心管放入离心机后离心5 min（转速为4 000 r/min）,然后将上清液用0.22 μm 有机相滤膜过滤,取50 μL 滤液加入100 μL 混合内标储备液,再用甲醇稀释至约1.0 mL,作为样品溶液。

1.4 色谱条件

色 谱 柱：ACQUITY BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美国沃特世科技有限公司)；柱温：40 ℃；进样体积：2 μL；流动相：A 相为水,B相为甲醇,流量为0.3 mL/min,梯度洗脱,洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.5 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子和负离子模式同时扫描；正离子喷雾电压：3 kV；负离子喷雾电压：2 kV；脱溶剂温度：500 ℃；脱溶剂气：氮气,流量为1 000 L/h；雾化气：氮气,压力为700 kPa；碰撞气：氩气,流量为0.15 mL/min；离子源温度：150 ℃；检测方式：多反应监测（MRM）模式。优化后的其它质谱参数见表2。

表2 特征选择离子及质谱参数

1.6 实验步骤

取1.2中混合标准工作溶液及1.3中样品溶液按1.4 色谱条件和1.5 质谱条件进行分析,以每种目标物的质量浓度与内标的质量浓度比值为横坐标,以定量离子色谱峰面积与内标物定量离子色谱峰面积比值为纵坐标建立14种物质的标准工作曲线,计算线性方程,利用标准曲线法计算样品中14种物质的含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

异噻唑啉酮类含杂环的物质在PFP（五氟苯基）柱上保留良好,实验室通过比较ACQUITY UPLC HSS PFP（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）与ACQUITY BEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）发现,五氟苯基柱虽能完好保留异噻唑啉酮类物质,但不能完全分离BP与异丁酯,故实验选用常规的C18柱。

选用水-甲醇为流动相,当在流动相中单独加入0.5 mmol/L 的甲酸或单独加入2 mmol/L 的乙酸铵时,虽然可以抑制样品电离,但酸的加入,导致负离子扫描模式下,SA、BA 及Bronopol 质谱信号被抑制。当在流动相中加入1 mmol/L氨水时,BA及SA保留变差,且大幅抑制了正离子扫描模式下异噻唑啉酮的响应。且在正、负离子模式下均采用水-甲醇为流动相可以方便实验操作,不需要更换流动相。因此最终确定选择水-甲醇体系作为流动相。6 种尼泊金酯、5种异噻唑啉酮、Bronopol、SA及BA色谱图见图1。

图1 混合标准溶液的色谱图

2.2 质谱条件的优化

用甲醇将6 种尼泊金酯、5 种异噻唑啉酮、Bronopol、SA及BA稀释至质量浓度均为100 ng/mL的标准溶液,通过针泵恒流进样方式注入质谱仪,流量为5 μL/min。首先在正离子模式下进行一级质谱扫描,确定目标化合物的母离子[M+H]+。然后使用子离子扫描进行二级质谱扫描,确定目标物的子离子信息,选择干扰小、响应值高的离子对,以响应值最高的碎片离子作为定量离子,次高的碎片离子作为定性离子。其次使用相同方法在负离子模式下进行扫描,确定目标化合物的母离子[M-H]-。然后使用子离子扫描进行二级质谱扫描。在负离子扫描过程中,由于BA 母离子在脱掉一个—COO-后形成的苯环非常稳定,因此仅能找到一个信号非常强的子离子,故仅选择一对离子对。SA 在确定母离子后,也仅能找到一个脱掉—COO-的子离子碎片峰,故这两个化合物均只使用一对离子对。Bronopol在负离子模式下扫描过程中发现,当选用[M-H]-（质荷比199）为母离子时,改变碰撞能均无法得到其子离子,可能由于Bronopol 极易在溶液中脱去一个—CH2OH[10],故选择m/z166为母离子。最终确定优化好的质谱参数见表2。

2.3 提取溶剂的优化

根据待测物的理化性质以及文献报道,尼泊金酯类溶于醇、醚和丙酮,极微溶于水；Bronopol 易溶于水、醇,且在碱性水溶液中会缓慢分解；异噻唑啉酮类微溶于水,微溶于醇,在pH 2～12 时均可使用；SA、BA 呈弱酸性,溶于水、甲醇。实验分别考察纯水、甲醇以及不同比例甲醇-水对样品的萃取效果。

采用甲醇-水为流动相,为保持与流动相一致,故分别采用纯水、甲醇、甲醇-水（体积比为20∶80、50∶50、80∶20）进行提取。在使用甲醇溶解时,水基胶溶液中出现絮状物,振荡后依然呈现团状物并有结块现象,无法全部分散。各种体系提取效率结果如表3。结果表明,采用纯水及甲醇-水（20∶80）溶剂进行提取时,发现DCOIT 的萃取效率较低,采用甲醇-水（80∶20）时各物质萃取效率最高（78.4%～116.6%）,因此采用甲醇-水（80∶20）作为提取溶剂。

表3 使用不同提取溶剂时目标物的提取效率 %

2.4 基质效应

以实际空白样品,采用基质加标法考察了不同稀释倍数下各目标合物的基质效应（ME）,即采用1.3样品预处理方式,得到空白基质液。配制质量浓度为500 ng/mL 的SA、BA,50 ng/mL 的Bronopol、MI、BIT,5 ng/mL 的6 种 尼 泊 金 酯、CMI、OIT、DCOIT 的基质标准溶液。用基质匹配标准工作溶液中各目标物的色谱峰面积减去标准工作溶液相应浓度的各目标物的色谱峰面积,再除以标准工作溶液相应浓度的各目标物的色谱峰面积,计算得基质效应值（ME）。ME 的正负分别表示基质增强和基质抑制效应。当|ME|小于20%时,表示弱基质效应,当|ME|为20%～50%时,表示中等基质效应,当|ME|大于50%时,表示强基质效应。不同稀释倍数时的基质效应值如表4。由表4可知,当将空白基质溶液稀释20倍后,各目标物在基质匹配工作溶液中的色谱峰面积与标准工作溶液中相应浓度的色谱峰面积相近,|ME|值均小于20%,为弱基质效应,因此将预处理后的样品稀释至20 倍体积,并加入内标,可最大程度减少基质效应对检测结果的影响。

表4 不同稀释倍数时的基质效应值

2.5 线性关系、检出限与定量限

按照1.2配制系列混合标准工作溶液,在优化的实验条件下进行检测,以每种目标物的质量浓度与内标的质量浓度比值为横坐标,以定量离子色谱峰面积与内标物定量离子色谱峰面积比值为纵坐标,绘制14种杀菌剂的标准工作曲线,计算线性方程和相关系数。

以信噪比大于等于3计算目标物在样品中的质量分数,作为方法检出限（LOD）,以信噪比大于等于10计算方法定量限（LOQ）。

14种杀菌剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限见表5。由表5可知,14种杀菌剂在对应的浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数均不小于0.998,检出限为0.01～0.81 μg/g,定量限为0.03～2.69 μg/g,均满足检测要求。

表5 14种杀菌剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.6 加标回收与精密度试验

选取一个空白烟用水基胶进行加标回收试验。设定低、中、高3个添加水平,每个添加水平做6个平行样品,按该方法进行测定并计算回收率和相对标准偏差,结果列于表6,空白样品及加标样品色谱图如图2～图6。烟用水基胶中待测物平均加标回收率为76.4%～125.4%,相对标准偏差为1.7%～12.2%,表明该方法准确度和精密度良好。

图2 尼泊金酯空白与加标样品色谱图

图4 Bronopol空白与加标样品色谱图

图5 SA空白与加标样品色谱图

图6 BA空白与加标样品色谱图

表6 加标回收率和相对标准偏差(n=6)

3 结语

建立了一种超高效液相色谱-串联质谱同时测定烟用水基胶中6 种尼泊金酯、5 种异噻唑啉酮、溴硝醇、山梨酸、苯甲酸共14种杀菌剂的方法,采用内标法定量。该方法具有操作简单、灵敏度高、重复性好、基质效应低等优点。可在较短时间内同时完成14 种杀菌剂的定性和定量检测。该方法为涉及烟用水基胶杀菌剂检测提供了有力的技术支持。