负载双氯芬酸钠的间充质干细胞外泌体对类风湿关节炎小鼠治疗的研究

王 喆，于海宽，孟佳琦，文 山，张传杰，梅晰凡锦州医科大学附属第三医院骨科，辽宁 锦州 00；辽宁省医学组织工程重点实验室，辽宁 锦州 00；解放军医学院，北京 0085；中国科学院大学，北京 0009

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以炎症和关节破坏为主要表现的慢性炎症性关节疾病，影响着全球约1%的人口，其中以中老年女性为主[1-2]。部分患者关节破坏较为严重，可引起关节畸形甚至残疾，严重影响个人和家庭的生活质量[3-4]。目前针对类风湿关节炎的主要治疗措施是控制炎症以延缓疾病的发展[5]。尽管用于治疗类风湿关节炎的药物很多，包括非甾体抗炎药、改善病情药物、生物制剂和靶向小分子药物，但仍有一些难治性类风湿关节炎患者对多种药物治疗反应差[6-8]。外泌体(exosome，EXs)是由细胞分泌的直径为40 ~ 160 nm 的囊泡，在细胞与细胞间或细胞与组织间的信号传导中发挥重要的作用[9]。EXs 具备良好的生物相容性和较低的细胞毒性，这使其成为一种良好的药物运输载体[10-11]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs) 来源的EXs 除了具备以上特点，还继承了MSCs 的修复损伤细胞或组织的特性[12]。本研究利用MSCs 来源的EXs，并将抗炎药物双氯芬酸钠(diclofenac sodium，DS)装载入其中，观察其对类风湿关节炎模型小鼠的治疗效果，为类风湿关节炎乃至其他炎症性关节疾病的治疗进行探索。

材料与方法

1 实验动物 DBA 小鼠(6 ~ 8 周，体质量18 ~22 g) 100 只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并在SPF 级别的动物房中饲养(温度20 ~22°C；湿度40% ~ 60%)，在12 h 光照/12 h 黑暗循环下，自由获取食物和水。

2 试剂和仪器 MEM α 培养基、青霉素/链霉素双抗、胰蛋白酶、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、Ⅱ型胶原(赛默飞世尔科技公司)；胎牛血清(Gibco 公司)；磷酸盐缓冲液、小鼠白细胞介素(interleukin，IL)-6 ELISA 试 剂 盒、小 鼠IL-1β ELISA 试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF) ELISA 试剂盒、DAPI、红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)；Anti-CD9、Anti-CD63 (Abcam)；双氯芬酸钠(Sigma-Aldrich)；纳米颗粒追踪分析(Particle Metrix 公司)；透射电子显微镜(JOEL 公司)；micro-CT (Caliper 公司)；冰冻切片机(Leica 公司)；激光共聚焦显微镜(Nikon 公司)。

3 间充质干细胞的提取 间充质干细胞从60 只小鼠长骨的骨髓中提取。颈椎脱位法处死DBA 小鼠，将其浸泡至75%乙醇中。转移小鼠至无菌操作台并进行固定，使用剪刀与镊子暴露出股骨和胫骨的骨干，使用注射器在骨干处钻孔并用预冷的MEM α 培养基冲洗骨髓腔3 ~ 4 次，然后300 g离心5 min。丢弃上清液，将5 mL 红细胞裂解物加入沉淀中并重悬，室温孵育3 min。300 g 离心5 min，弃上清，最终得到骨髓细胞，在含10%胎牛血清和1% 青霉素-链霉素的MEM α 培养基中培养。

4 外泌体的提取和表征 将收集到的MSCs 上清分别在300 g 和2000 g 下离心10 min。将得到的上清液10000 g 离心30 min。再将获得的上清液100000 g 下超速离心两次，以获得外泌体。通过透射电镜观察外泌体的形貌，纳米颗粒追踪仪分析外泌体的粒径和电位，免疫印迹法检测表面蛋白CD9 和CD63。

5 外泌体内装载双氯芬酸钠 将1 mg 双氯芬酸钠均匀分散在1 mL Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5)，配制成双氯芬酸钠溶液。配制300 µg/mL 的外泌体溶液。将双氯芬酸钠溶液加至外泌体溶液中进行超声处理，超声功率为120 W，On/Off 各20 s。每进行1 次处理后置于冰浴1 min，重复3 次上述操作。超声结束后将溶液置于37℃的水浴中孵育1 h。孵育结束后超滤柱除去多余的药物分子。

6 类风湿关节炎模型小鼠的构建 将完全弗氏佐剂和Ⅱ型胶原等体积混合并制成均匀的乳剂，在40 只DBA 小鼠尾部的皮下注射100 µL 乳剂。21 d后，使用同样的方式将100 µL 不完全弗氏佐剂与Ⅱ型胶原混合后的乳剂注入小鼠尾部皮下。28 d时对小鼠进行评分[13]。评分＞4 分的小鼠视为模型初步构建成功并入组。评分标准如下：0 分，正常；1 分，局限于足中部和脚踝关节的轻度肿胀和红斑；2 分，轻度肿胀和红斑从足中延至脚踝关节；3 分，中度肿胀和红斑从足趾关节延伸到脚踝；4 分，严重肿胀和红斑覆盖足部、脚踝和脚趾。之后对不同治疗组小鼠的足踝部每3 d 进行1 次评分。

7 外泌体靶向分析 将100 µL DIO 标记的EXs和脂质体通过尾静脉注射到类风湿关节炎模型小鼠体内。4 h 后截取小鼠的关节部位，于甲醛溶液中固定2 d。然后再进行脱钙2 周。使用OCT 胶对关节进行包埋，将其切成8 µm 的薄片。清洗后使用DAPI 核染，激光共聚焦观察DIO 标记的外泌体在关节处的聚集。

10 统 计 学 分析 数 据 采 用GraphPad Prism 9.0进行计算和统计。计量数据以x¯±s表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 DS@EXs 的 表 征 透 射 电 镜 观 察 到EXs 和DS@EXs 的形态均呈典型的茶托样(图1A)。EXs粒径保持在100 nm 左右并且电势维持在-12 mV 左右，在EXs 中装载DS 后，粒径和电势均未发生明显变化(图1B，图1C)。Western blot 检测EXs表面的标志性蛋白CD9 和CD63，在装载DS 后两种蛋白仍有表达(图1D)。提示在装载DS 后，并未对EXs 的基本性质造成影响。

图1 DS@EXs 的表征A：EXs 和DS@EXs 的透射电镜图像；B：EXs 和DS@EXs 的粒径；C：EXs 和DS@EXs 的电势；D：通过Western blot 对EXs 和DS@EXs 标志物(CD9 和CD63)的分析Fig.1 Characteristics of DS@EXs A: TEM images of EXs and DS@EXs; B: Particle sizes of EXs and DS@EXs; C: Zeta potentials of EXs and DS@EXs; D: Western blotting analysis of the markers (CD9 and CD63) of EXs and DS@EXs

2 DS@EXs 在小鼠体内靶向性 将DIO 标记的脂质体和DS@EXs 通过尾静脉注射至类风湿关节炎模型小鼠体内，4 h 时收集膝关节样本，免疫荧光分析脂质体和DS@EXs 的分布。由于脂质体对炎症部位无靶向性，因此在关节腔中的聚集较少。而DS@EXs 具有靶向性，在关节处的聚集更加明显(图2A)。定量分析显示DS@EXs 在关节处的聚集高于脂质体(P＜0.05，图2B)。

图2 DS@EXs 的体内靶向能力A：脂质体和EXs 在小鼠关节中的聚集；B：图A 的荧光定量Fig.2 Targeting ability of DS@EXs in mice A: Accumulation of liposomes and EXs in the joint of mice;B: Fluorescence quantification of figure A

3 DS@EXs 的抗炎效果 类风湿关节炎模型小鼠的关节炎评分随着病程的发展逐渐升高。接受了游离DS 或EXs 治疗的小鼠，关节炎评分均轻微下降。而接受DS@EXs 治疗的小鼠，关节炎评分显著下降(P＜0.05，图3A)。43 d 时，与PBS 组相比，DS@EXs 组IL-6、IL-1β 和TNF 的水平分别下降了52.8%、63.8%和52.5% (P＜0.05，图3B)。

图3 DS@EXs 的抗炎效果A：治疗结束后各组小鼠关节炎评分；B ~ D：各组小鼠血清中炎症因子的水平Fig.3 Anti-inflammatory effect of DS@EXs A: Arthritis score of mice in each treatment group at the end of the therapy; B - D: The levels of inflammatory cytokines in serum of mice from each group

4 DS@EXs 对关节的保护作用 Micro-CT 图像显示，与游离DS 组和EXs 组相比，DS@EXs 显著减弱了骨侵蚀(图4A)。类风湿关节炎模型小鼠经过DS@EXs 治疗，骨矿物质密度显著上升，达1195.03 mg/cm3(P＜0.05，图4B)。提示DS@EXs可以有效减缓关节的损伤。

图4 DS@EXs 对关节的保护A：在实验终点各组的小鼠踝关节micro-CT 图像；B：各组踝关节骨矿物质密度比较Fig.4 Protective effect of DS@EXs on joint A: Micro-CT images of ankle joints at the endpoint of the experiment from each group; B: Comparison of bone mineral density from each group

讨 论

尽管RA 的病因未明，但其显著的特征之一就是持续的炎症[14]。大量的免疫细胞在发病过程中涌入关节腔，包括中性粒细胞、巨噬细胞、效应T 细胞和B 细胞，通过释放炎症因子(如IL-6、IL-1β 和TNF)和一些小分子物质(如前列腺素和活性氧)，引起滑膜增生以及弥漫性炎症[15-16]。关节软骨在关节中起到润滑和减震的作用，而增生的滑膜会对软骨进行破坏，促进Ⅱ型胶原的降解，使其失去本有的力学性能[17-18]。IL-1β 可以抑制软骨细胞蛋白多糖的合成，还能刺激一些蛋白降解酶的产生[19]。骨侵蚀同样也是RA 的另一个重要特征[20]。骨侵蚀很大程度上与破骨细胞有关，而在这个过程中，炎症因子起到了激活破骨细胞的作用，进而导致关节的进行性破坏[21]。因此，阻断炎性反应的发展或清除炎症因子都被视为控制RA 的有效措施[22]。

在过去十几年的探索中，EXs 逐渐成为一种理想的药物运输载体，通过将不同的药物、小分子蛋白以及治疗性的核酸装载到EXs 中，靶向递送至特定的细胞或者组织中，同时还能减少因在其他部位药物聚集而引起的不良反应[23]。Tian 等[24]证明连接单抗的外泌体可以有效抑制老年黄斑疾病的炎症，并且未对小鼠造成明显的不良反应。Wang 等[25]通过外泌体有效抑制肿瘤转移和肿瘤复发。MSCs 来源的EXs 还可以促进损伤部位的修复，包括骨与软骨。Li 等[26]发现MSCs 来源的EXs 可以减弱腰椎小关节骨性关节炎模型小鼠软骨与软骨下骨的损伤。还有研究发现，MSCs来源的EXs 可以上调软骨细胞中聚集蛋白聚糖、SOX9、COL9A1 和COL2A1 的表达，同时下调MMP13 的表达以保护软骨[27]。

本研究通过将非甾体抗炎药物DS 装载入MSCs 来源的EXs，以构建高效治疗RA 的药物递送体系。一方面，DS@EXs 能够将DS 运输至关节损伤处以发挥抗炎功效，通过关节炎评分可以看出，由于局部药物浓度的提升，足部的红肿较DS 组有明显的缓解；此外，炎症因子的降低也充分展示了DS@EXs 的高效抗炎能力。另一方面，通过EXs 发挥修复损伤关节的作用，micro-CT 图像清晰地展示了经过DS@EXs 的治疗，关节的破坏有所减缓。

在DS@EXs 的基础上，有望通过进一步的化学修饰或基因工程以加强其靶向性和抗炎功效，或根据疾病的病理特征赋予其新的治疗作用。如将抗风湿药物连接至外泌体表面也能够加强药物的靶向递送，或通过转染使得MSCs 过表达修复因子，进而使其分泌的外泌体包含更多的修复因子。另外，DS@EXs 还有望运用至其他炎症性疾病，如骨关节炎，这将有利于进一步扩大DS@EXs 的应用场景。这意味着其应用潜力是值得挖掘的。DS@EXs 的成功构建，为后续开发和推广奠定重要基础。随着进一步的研究，基于外泌体的应用将会更加广泛，对疾病的体内跟踪、预后监测和靶向治疗具有深远的意义。

作者贡献梅晰凡：构思、设计研究，稿件修订；王喆：完成整体实验，撰写初稿；于海宽、孟佳琦：协助对数据进行分析和研究；文山：协助实验方法的改进；张传杰：协助动物模型的构建。

利益冲突所有作者声明无利益冲突。

数据共享声明本篇论文相关数据可依据合理理由从作者处获取，Email：wangzheglow@163.com。

5I ngegnoli F， Cavalli S， Giudice L， et al. Caffeine and rheumatoid arthritis：a complicated relationship［J］. Autoimmun Rev，2022，21（7）： 103117.

6B uch MH，Eyre S，McGonagle D. Persistent inflammatory and non-inflammatory mechanisms in refractory rheumatoid arthritis［J］. Nat Rev Rheumatol，2021，17（1）： 17-33.

10晏 梓钧，茹楠，蔡梦溪，等. 外泌体改造和修饰研究进展［J］.解放军医学院学报，2019，40（12）： 1203-1206.