某地区药食同源食物真菌污染情况的调查研究

◎ 陈佳佳，丁 乐，张嫚玲

（长沙医学院，湖南 长沙 410219）

中药材的使用和我国医学和特色医药的发展推广密不可分。药食同源食物是中药材资源中应用最广泛的一类，但其应用却受限于药食同源食物的性质。药食同源食物中含有水，容易被真菌或真菌毒素污染，尤其是生粉入药和发酵类制剂的污染时有发生。湖南自古被称作“卑湿之地”，多雨潮湿，形成了嗜辣的风俗，但食用过多的辣椒容易上火。百合、莲子、薄荷是商超中较为常见的药食同源食物，具备养阴润肺、安心养神、补脾健胃、清热降火、促进睡眠和利咽止痛等功效，是居民较为喜好的食物。由于光照、温度、气候等诸多因素的影响，药食同源食物通常会受到真菌的污染，产生真菌毒素，引起肾毒性、肝毒性等毒性反应[1-3]。药食同源食物的开发是一个漫长复杂的过程，如果不能妥善处理各个环节，就可能会对药食同源食物造成污染，影响药食同源食物的质量[4]。目前，我国对于药食同源食物真菌污染的限量未提出明确规定，调查药食同源食物真菌的污染情况，以便强化药食同源食物的质量管理。考虑到药食同源性食物真菌污染的普遍性及严峻性，需了解不同药食同源食物真菌污染的具体特征，这对整体强化该类污染防控具有重要指导作用。

1 材料与方法

1.1 研究材料

本文研究的药食同源性食物主要包括百合、薄荷、莲子3类，均采购于湖南省线下药店。2022年6—12月，随机抽取湖南省14个市州中的3个市州（市内区域），每个城市随机选择1家零售药店购置药食同源食物18份，药食同源性食物均使用无菌袋独立包装，均处于保质期内，且原始包装（真空包装）无破损。采购完成，当即送检，实验室取出各药食同源性食物进行后续操作。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株分离

称取药食同源食物百合、薄荷、莲子各1 g，粉碎后置于10 mL无菌水中，摇匀，置于4 ℃培养箱中过夜，稀释样品悬液到10-1、10-2、10-3和10-4，在培养基涂布10-3、10-4两个梯度，而后将培养基放入培养箱内，27 ℃培养7～14 d。培养真菌菌落，根据菌落形态、颜色、干燥性等特征，选择形态差异较大的真菌，及时转移到相应的培养基上，划线、分离、纯化。为了获得纯菌落，进行3次分离和纯化步骤。将分离的菌株暂存于酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，储存在4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 菌落观察

在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基平板上接种纯化菌株，27 ℃培养7～14 d，观察并记录菌落大小、颜色、质地和分泌物等特征。在载玻片上滴一滴水，刮取少量菌丝和孢子，盖上盖玻片。10×40倍光学显微镜观察菌丝的大小和形状、孢子的颜色和形状，进行初步鉴定。

1.2.3 菌株鉴定

将50 μL微生物裂解液加入1.5 mL离心管中，将离心管内的菌丝进行适度热处理，处理温度控制在80 ℃，离心5 min，取上清液。根据GenBank中菌株AJ005676.1Penicillum expansum和GU565108.1Penicillum janthinellumITS区域，基于Primer-Blast（NCBI）完成Wen1F/Wen1R引物设计，Nucleotide Blast证实这2种引物可以有效匹配青霉属数类真菌株，能成功鉴定很多真菌。针对菌株KC146411.1Aspergillus FlavusITS区域，设计了引物Wen2F/Wen2R，比对结果显示可以用于曲霉属物种的鉴定。PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳。PCR产物上样提取量为5 μL，恒压120 V，琼脂糖凝胶1%，电泳缓冲液1×TAE，电泳时间15 min，拍照设备采用凝胶成像系统。PCR扩增产物测序获得相关数据，登陆NCBI/BLAST检索测序结果，找出与获得片段同源性最高的真菌菌株序列。

2 结果与分析

2.1 菌株平板菌落形态及显微观察

曲霉菌丝有隔膜，为多细胞霉菌，分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，一般呈球形。曲霉的孢子常见黑色、橙红色、黄色，无色的部分是菌丝。青霉菌的营养体为无色或淡色的菌丝体，菌丝各细胞之间有横膈膜，分生孢子梗顶端呈特殊的对称或不对称的扫帚状，在显微镜下观察到大量绿色成串的青霉孢子。枝孢菌落平展或偶作突点状，呈橄榄色、灰色、褐色或深黑褐色，融状，絮状或毛发状，在显微镜下观察到分生孢子链生，呈枝链分布，椭圆形，表面光滑。

2.2 3种药物各类真菌检出情况

药食同源食物样本总量为18份，真菌污染的样本为16份，污染率为88.9%，表明真菌污染普遍。从18份药食同源食物样品中共分离到真菌46株，其中青霉13株，占分离总菌株数的28.3%；曲霉17株，占分离总菌株数的37.0%；枝孢菌5株，占分离总菌株数的10.9%；无法准确分类的真菌株有11株。由此可知，曲霉菌污染最常见。

3种药食同源食物相比，薄荷受真菌污染最普遍，成功分离17株真菌；百合中分离出13株真菌；莲子的污染率相对较低，分离出5株真菌。序列相似性99%以上将做出同种判定。就各菌属分布来看，从多到少依次为曲霉属17株、青霉属13株、枝孢菌5株、无法准确分类的菌株11株。详见表1。

表1 3种药食同源食物各类真菌检出情况表

3 结论与讨论

药食同源性食物真菌中毒导致的不良事件偶有发生，在种植、加工、贮存等环节，均有被污染的风险。此外，真菌毒素种类众多，部分真菌毒素（黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等）对患者身体健康有典型且显著的损害作用，甚至致癌，因此在日常工作中需高度重视真菌污染的防范。本研究基于真菌分子鉴定法成功分离46株真菌，并完成鉴定；百合中曲霉菌属、青霉菌属污染相对严重，结果与文献一致[5]。莲子中主要为青霉菌，莲子污染率较百合、薄荷低。枝孢菌属在本研究中检出率次于曲霉属和青霉属，其很少致病，但有皮肤和脚指甲感染、鼻窦炎、肺部感染的研究报告。如果不能及时处理，这些感染可能会引发肺炎。霍晓菲等[5]对中药材及中药饮片微生物污染情况的调查发现，曲霉和青霉为药食同源食物真菌感染的优势菌群，其中薄荷污染率最高，该调查客观说明了药食同源食物主要感染的真菌类别。药食同源食物曲霉检出较为常见，这与药食同源食物在种植过程中不可避免遭受的自然界黄曲霉菌和寄生曲霉的侵染有关，也与在外界高温、高湿环境中短时间存在，导致曲霉快速生长、繁殖，进一步提升了被污染的风险有关。药食同源食物发生霉变的主要环境因素有温度、湿度、空气、光线和酸碱度等，青霉菌的耐热性很强，菌体繁殖温度较低，在外界环境中容易大量繁殖，导致该类污染较为常见。

本研究菌株鉴定采用较为新颖的序列分析方法，该法不同于传统形态学的观察方法，能有效鉴定出不产孢真菌，提高药食同源食物真菌污染菌群检测的准确性，缩短检测时间，提升检测效率[6-7]。湖南省作为百合、莲子、薄荷等药食同源食物的种植和产出大省，需严格把控药食同源食物的种植、采摘、生产和储存等环节的产品质量，长期储存药食同源食物必须采用适当的技术，防潮防热，阴凉干燥，以源头为切入点，全面检测各环节产品的真菌污染状况，设置限量标准，尽可能防范真菌污染，确保药食同源产品的质量及使用安全。