联合UPLC-QTOF-MS与HS-SPME-GC-MS 测定赣南脐橙果肉化学成分

刘渝辰，余迎利,，甘思逸，刘宇鑫，金汝生，蔡新送，叶咏虹，毛雪金,，王远兴,,

（1.南昌大学 食品科学与资源挖掘全国重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学食品学院，江西 南昌 330047）

脐橙是世界农业与经济领域最重要的水果作物 之一[1]，它含有许多必需的维生素、氨基酸、类黄酮、酚酸和植物化学物质[2]。脐橙具有抗氧化、抗癌、抗炎、镇痛、抗过敏、预防和治疗心血管疾病、免疫、抗菌等多种功能[3]。具有生物活性的黄酮类化合物有利于身体组织的生长、发育和修复[4]。它们具有不同的生物学特性（抗菌、抗炎、抗氧化、增强免疫、调节脂质代谢和保护肠道健康）[5]。据报道，脐橙具有多种生物活性，包括抗氧化[6-7]、抗糖尿病的潜力[8]。

赣南脐橙是一种营养丰富的水果，产自中国中部的江西省赣州市。赣南特有的富硒红壤土层深厚，土壤呈酸性富含微量稀土元素，有利于糖的积累和香气的形成[9-10]。赣南气候属亚热带湿润季风气候，具有日照充足、降水充足、昼夜温差大等优点。气候有利于脐橙的生长[11]。赣南脐橙是赣南地区的受保护地理标志产品，它还含有以橙皮苷和柚皮素为主的黄酮类化合物和氨基酸、类胡萝卜素[12]。赣南脐橙和柚子、柠檬等水果类似，含有多种抗氧化分子例如多酚、抗坏血酸，这些抗氧化分子可以抑制自由基对人体的有害影响，柑橘中黄酮类化合物芦丁、橙皮苷、柚皮素、柚皮苷和类柠檬苦素是身体组织生长、发育和修复所必需的[13-14]。它是一种重要的柑橘类水果，食用具有促进健康和保护肠道健康的优点。脐橙中含有橙皮苷、芦丁、柚皮苷等黄酮类化合物，在中药中具有清热去火的效果，橙皮苷能扩展支气管，具有清热化痰、疏郁理气、抗炎和抗过敏的功效，芦丁对高糖高脂饮食导致的小鼠肾脏损害具有保护作用[15-20]。

到目前为止，赣南脐橙化学成分的研究并不充分，采用多种类型分析方法全面检测其化学成分，对于赣南脐橙的质量分析和控制十分有利，故本研究联合超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole timeof-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）技术与顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术填补赣南脐橙中的挥发性和非挥发性化学成分的空缺，有助于未来赣南脐橙成分的进一步提取和利用研究。因此，采用UPLC-QTOF-MS、HS-SPME-GC-MS具有十分显著的优势，二者具有高分辨率、高灵敏度、全扫描等优点。它已被广泛应用于各种食品中化学成分的表征和鉴定[21]，该技术已成功用于多个领域的非挥发性化合物的定性和定量分析，如大鼠血浆、红酒、青钱柳和绿茶的测定[22-25]，该技术在食品检测领域具有广阔的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2021年12月采摘成熟赣南纽荷尔脐橙，所有样品均采自江西省赣州市4 个主要产区的4 个果园，海拔高度均为200～250 m区间，果树树龄均为12 a。以赣南地区瑞金鹏飞果业（E 115°51′36″，N 25°49′48″）、信丰县宝利果业（E 114°56′24″，N 25°20′24″）、安远仟唐农业（E 115°22′12″，N 25°9′）、南康区俊萍果业（E 114°47′24″，N 25°30′36″），以4 个赣南脐橙协会认证果园的商品成熟脐橙为原料，每个果园选取20～30 个正宗原橙样品进行分析。

甲醇（色谱级）德国Merck公司；蒸馏水 美国Watson公司；甲酸（LC-MS级）美国ROE Scientific INC公司；正构烷烃标品混合物（C7～C40）德国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

1290 UPLC-6538 QTOF-MS（配有MassHunter Qualitative Analysis和MassHunter Mass Profiler数据处理软件）、7890A气相色谱仪-7000三重串联四极杆质谱联用仪 美国Agilent公司；57330-U SPME萃取手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Sigma公司；AL104电子天平 瑞士Mettler Toledo公司；TDL-5-A离心机 北京东方精华苑科技有限公司；KQ5200E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS检测

在赣南4 个县典型脐橙产区，采集成熟脐橙为研究对象，在果园中随机抽取。用榨汁机提取脐橙可食用果肉样品，称取3 g果肉样品于20 mL顶空萃取瓶中，将顶空萃取瓶置于50 ℃水浴锅中平衡30 min，再将萃取头插入顶空萃取瓶中萃取吸附25 min。然后用GC-MS萃取5 min。采用GC-MS对脐橙的挥发性成分进行测定。

GC条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；载气为氦气，流量为1 mL/min；分流比为5∶1，进样量1 µL；升温程序：初始温度35 ℃，保持5 min，以6 ℃/min升温到60 ℃，保持20 min；以3 ℃/min升温到140 ℃，维持1 min；以5 ℃/min升至250 ℃，维持3 min，总分析时间62.83 min。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；传输线温度275 ℃；离子源温度230 ℃；母离子m/z285；激活电压1.5 V；质量扫描范围m/z50～450。

1.3.2 UPLC-MS检测

采收的果实立即运至实验室冻干后，将这些样品磨成细粉过筛，放入-20 ℃的冰柜中保存，直至使用。使用时称取1 g冻干粉，将冻干粉与15 mL萃取剂（80%甲醇）充分混合，30 ℃超声提取30 min，再使用 4500 r/min离心10 min，收集上清液，重复3 次，最后将上清液使用80%甲醇溶液定容到50 mL容量瓶中，用0.22 μm PTFE的滤膜过滤，装入进样瓶，用于上机分析。相同产地脐橙设8 个生物重复。

UPLC条件：Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温25 ℃；流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为甲醇含0.1%甲酸。梯度洗脱程序：0～12 min，97%～70% A，3%～30% B；12～27 min，70%～22% A，30%～78% B；27～32 min，22%～5% A，78%～95% B；32～37 min，22%～97% A，78%～3% B；流动相流速0.3 mL/min；进样量5.0 μL。

MS条件：正、负离子模式；电喷雾离子源；质量扫描范围m/z100～1500；碰撞气：氮气；毛细管电压3500 V；碰撞电压125 V；碰撞能10～50 eV；干燥气流速11.0 L/min；干燥气（N2）温度325 ℃；雾化气压力40 psi；八极杆射频电压750 V；离子扫描范围m/z100～1500；二级碰撞能10～50 eV；参比离子：负离子，m/z112.9856、1033.9881；正离子m/z121.0509、922.0098。

1.3.3 保留指数计算

各组分的保留指数（retention index，RI）计算以正构烷烃标定混合物为基础，利用Kovats方程计算：

式中：tx为待测组分的保留时间/min；n和n＋1分别表示正构烷烃的碳原子数；其中tn＜tx＜tn＋1。

1.4 数据统计及图表绘制

采用安捷伦MassHunter B.07.00采集软件进行所有的操作、采集和数据分析。通过在METLIN（http://metlin.scripps.edu/）、Chemspider（https://www.chemspider.com/）、Food Database（http://foodb.ca/）、MassBank（http://www.massbank.jp/）等数据库进行物质检索，鉴定非挥发性化合物。Venn图和总离子流图使用https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html在线网站以及Origin2021绘图软件制作。挥发性有机化合物鉴定采用NIST 17 MS Library进行，使用NIST 17数据库通过比较质谱信息与已发表文献RI识别未知化合物。

2 结果与分析

2.1 GC-MS测定结果

2.1.1 主要挥发性成分

萜类化合物是柑橘类植物精油的主要香味成分。GC-MS分析发现，脐橙中含量最高的萜类化合物为α-蒎烯、β-月桂烯、D-柠檬烯和芳樟醇。α-蒎烯是合成香料的重要成分[26]，β-月桂烯呈无色或淡黄色液体，具有淡淡的香脂香气，存在于红茶、砖茶、沱茶等发酵后茶中，发酵后含量增加[27]。D-柠檬烯作为柠檬精油的成分之一，具有预防皮肤癌、预防胃癌增生和促进癌细胞凋亡的作用[28]，芳樟醇是一种天然的单萜化合物，存在于香菜等植物中，具有抗肿瘤和抗心脏毒性作用[29]。

醇类的含量在香味成分中起着重要作用。在检测到的97 种挥发性化合物中，醇类含量较高，具有绿叶、青草和水果味，多汁的细微差别，醇类挥发性化合物是在水果生长发育过程中通过一系列酶促反应形成的。3-己烯-1-醇是一种在许多新鲜水果和蔬菜中发现的绿色草化合物，被广泛用作加工食品的添加剂风味剂[30]，1-癸醇是一种透明无色液体，具有甜花香味，与香茅醇和鸢尾根油的混合物类似，常用于制造精油[31]。总体而言，醛类比萜类具有更好的抗菌活性。已有研究表明，适量的己醛可以延长柑橘果实的贮藏时间[32]，壬醛可以抑制柑橘中酸腐菌的生长速度[33]。2-十一烯醛有一种类似柑橘皮的蜡状、略带肥皂味的香气，广泛存在于新鲜水果和蔬菜中。3-隐品酮在稀释时具有强烈的香料以及草本植物香气。3-辛酮有蘑菇、奶酪和发霉的水果的细微差别，而1-辛烯-3-酮具有强烈的奶油、泥土、蘑菇与鱼和植物香气。这些化合物是脐橙果肉风味重要的组成成分，许多挥发性化合物在脐橙皮和橙汁研究中鲜见报道，本研究使赣南脐橙挥发性成分数据库更详实。

2.1.2 挥发性组分差异

如图1、2和表1所示，安远组特有的挥发性组分有6 个：香茅醇（44）、对-1-烯-9-醛（57）、反-香芹醇（59）、紫苏醇（68）、橙花醇乙酸酯（72）、β-古巴烯（78）；南康组特有的挥发性组分有7 个：安息香醛（12）、己酸乙酯（21）、反式-2-己烯酸（27）、3-羟基己酸甲酯（29）、辛酸甲酯（41）、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇（49）、别香橙烯（84）；瑞金组特有的挥发性组分有5 个：3-辛酮（17）、反式-2-壬烯-1-醇（45）、2,4-壬二烯醛（56）、γ-桉叶烯（85）、广藿香奥醇（95）；信丰组特有的挥发性组分有6 个：1-辛烯-3-酮（15）、丁酸丁酯（20）、4-异丙烯基甲苯（35）、隐品酮（48）、香茅醇（61）、β-瑟林烯（80）；安远、南康、瑞金、信丰4 组的共同挥发性组分有36 个。

图1 采用HS-SPME-GC-MS方法检测脐橙果肉总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile components of navel oranges identified by HS-SPME-GC-MS

图2 采用HS-SPME-GC-MS方法得到脐橙挥发性成分Venn图Fig.2 Venn diagram of volatile components of navel oranges identified by HS-SPME-GC-MS

2.2 LC-MS检测结果

2.2.1 有机酸类

有机酸在柑橘类水果中广泛分布，国外研究表明食用含有机酸的柑橘水果有益人体健康[34]。有机酸在植物生长的所有阶段都发挥着重要作用，影响着植物的中枢代谢，如线粒体呼吸代谢[35]和细胞氧化还原代谢[36]。在赣南脐橙果肉中鉴定出20 种有机酸，在负离子模式下检测到质谱准分子离子峰为m/z117.0189 [M-H]-，以及二级质谱中碎片离子为m/z99.0093 [M-H-H2O]-、73.0303 [M-H-CO2]-、55.0187 [M-H-HCOOHH2O]-，结合数据库及文献[37]数据比对，最终鉴定该化合物为琥珀酸（25）[37]。负离子模式下，在m/z133.0159处出现准分子离子峰，保留时间为1.133 min，而m/z115.0053是由于失水而形成的。m/z133.0159的碎片离子去除一分子CO2得到m/z89.0245的碎片离子。m/z71.0140的碎片离子由准分子离子形成去除一分子[HCOOH]-残基碎片，随后脱一分子水，再从分子的剩余部分迁移2 个氢而产生，这些化合物碎裂模式的产生都包含水分子的中性损失。m/z133.0159的碎片离子去除C2H2O3得到m/z59.0140的碎片离子，通过比较文献[38]中化合物的质谱碎片断裂模式，该化合物被鉴定为D-(＋)-苹果酸（14）。同时，通过查阅代谢物数据库、质谱数据网站和相关文献[38]，鉴定出柠檬酸（21）和脱落酸（91）等具有相似裂解模式的有机酸，裂解途径如图3 所示。负离子模式下，在保留时间为1.813 min 时，化合物21在m/z147.0314处出现准分子离子峰，推测分子式为C5H8O5。次级碎片离子主要分布在m/z129.0202、103.0398、87.0097和77.9222，其中m/z103.0398的碎片离子是由[C5H8O5]-丢失一分子[CO2]-形成的。m/z129.0202是由母离子去除H2O分子形成的碎片离子，而m/z87.0097是由母离子失去[HCOOH]-形成的，初步鉴定为柠檬酸（21）。VC（17）的母离子为m/z175.0210 [M-H]-，失去C2H5O2生成m/z115.0048，或持续失去C3H4O3生成m/z87.0100。化合物110在m/z为187.0968时显示[M-H]-离子。化合物110的质谱在m/z125.0963 [M-H-H2OCO2]-、97.0659 [M-H-H2O-CO-CO2]-处出现了特征碎片离子，初步鉴定化合物110为壬二酸（110）[38]。

图3 脱落酸（A）、柠檬酸（B）、D-()-苹果酸（C）的 MS/MS裂解途径Fig.3 Possible MS/MS fragmentation patterns of abscisic acid (A),citric acid (B) and D-(+)-malic acid (C)

化合物91在m/z263.128 [M-H]-时表现为准分子离子峰主片段，对应分子式为C15H20O4，在m/z219.137 [M-H-CO2]-时为主碎片离子，结合文献[39]及数据库鉴定化合物91为脱落酸。脱落酸是一种具有生长调节作用的植物激素，可促进叶片休眠、老化和脱落[39]。化合物58负离子模式下m/z341.0859 [M-H]−碎片离子在m/z179.0339出现，对应基团为咖啡酰基，结合文献[40]以及在m/z135.0454处出现CO2丢失的特征离子，鉴定为咖啡酸己糖苷（58）[40]。

在正离子模式下，检测二级质谱中在保留时间0.873 min存在m/z175.1191 [M＋H]＋、158.0920 [M＋H-NH3]＋、130.0972 [M＋H-NH3-CO]＋、116.0707 [M＋H-CH5N3]＋、70.0653 [M＋H-CH5N3-CH2O2]＋、60.0557 [M＋H-NH3-CO-C2H4N3]＋等裂解碎片，结合文献[37]并且根据化合物的确切分子质量和裂解方式，推断化合物为L-精氨酸（1），分子式为C6H14N4O2。同理结合文献[40]，0.979 min观察到m/z为98.0624 [M＋H-H2O]＋和70.0654 [M＋H-HCOOH]＋的特征碎片离子，最终推断为L-脯氨酸（6）[41]。

2.2.2 黄酮及糖苷类

黄酮类化合物存在于多种柑橘类水果、浆果等水果中，在调节植物生长发育中发挥重要作用，赋予植物细胞丰富的色彩[42]。最新报道表明，黄酮类化合物也可以作为一种有效的抗癌剂应用于保健食品行业中[43]。黄酮的主要断裂模式包括损失一系列中性小分子，如H2O、CH3、CO2、CO和Retro-Diels-Alder裂解产生碎片片段离子[43]。在保留时间为15.474 min时，在m/z561.1509、451.1246、199.1059、331.0799、289.0700、129.0565、85.0286处检测到丰度较高的产物离子，鉴定为圣草次苷（93）。以4′,5,6,7-四甲氧基黄酮（123）为例，该化合物在测试样品中的保留时间为25.172 min，根据一级质谱离子峰为m/z343.1175 [M＋H]＋，推测出分子式为C19H18O6。碎片离子分别为m/z327.0878 [M＋H-CH4]＋、313.0725 [M＋H-C2H6]＋、309.0771 [M＋ H-CH4-H2O]＋、299.0919 [M＋H-CH4-H2O]＋、285.0759 [M＋H-C2H6-CO]＋、253.0843 [M＋H-2·CH3-C9H8O]＋、181.0144 [M＋H-2·CH3-C9H8O]＋、153.0189 [M＋H-2·CH3-C9H8O-CO]＋和135.0442 [M＋H-·OCH3-C10H9O3]＋。结合质谱裂解规律以及相关文献[44]佐证和在线网站数据库，最终鉴定该化合物为4′,5,6,7-四甲氧基黄酮（123），裂解规律如 图4所示[44]。

图4 橙皮苷和4′,5,6,7-四甲氧基黄酮的MS/MS裂解途径Fig.4 Possible MS/MS fragmentation patterns of hesperidin and 4′,5,6,7-tetramethoxyflavone

化合物101在m/z273.0762处显示[M＋H]＋离子，计算出C15H12O5的元素组成。化合物101的碎片离子为m/z273.0762 [M＋H]＋、m/z231.0540 [M＋H-42]＋、189.0544 [M＋H-84]＋、179.0332 [M＋H-94]＋、153.0195 [M＋H-C8H8O]＋、147.0464 [M＋H-C6H6O3]＋、119.0468 [M＋H-C7H6O4]＋。将实验数据与文献[45]参考数据进行比较，化合物101被鉴定为柚皮素[45]，柚皮素主要以葡萄糖苷的形式存在，广泛存在于枳、柚子、橘子、橙子等芸香科植物的果皮和果肉中。化合物115在m/z625.1738处显示分子离子[M＋H]＋，分子式为C28H32O16。化合物115在m/z479.1158 [M＋H-146]＋、317.0642 [M＋H-308]＋、129.0512 [M＋H-496]＋处有碎片离子，鉴定为异鼠李素-3-O-芸香糖苷（115）[46]。化合物69显示m/z为449.1076 [M-H]-的前体离子，结合碎片m/z431.0869 [M-H-H2O]-、287.0503 [MH-glucose]-和269.0422[M-H-H2O-glucose]-的片段以及文献[47]，鉴定为黄诺马苷（69）。化合物75m/z433.1127，分子式为C21H22O10，产生的m/z为273.0767 [M-H-146]-和153.0184 [M-H-146-120]-的产物离子为洋李苷的典型碎裂模式[48]。化合物96初步鉴定为芦丁，m/z301.0352的主要片段是由槲皮素3-O-芸香糖苷中芸香糖苷基团的损失产生[49]。

2.2.3 酚酸类

酚酸广泛分布在水果和蔬菜中，受到越来越多的关注，由于其具有生物活性的植物化学物质[50]，酚酸被用作人类的膳食补充剂和中药[51]。绿原酸（23）、对香豆酸（45）和香草酸（41）为代表性化合物。在负离子模式下，一级质谱提供的准分子离子峰为m/z353.0852 [M-H]-。将该化合物裂解后，在m/z191 处产生了一个位置特异性片段，结合文献[45]参考数据库比对，对应的是失去咖啡酸自由基，即绿原酸（23）。同理，化合物41在质谱上存在m/z为167.0334 [M-H]-的分子片段，在二级质谱中，负离子模式下二级质谱提供的碎片离子分别为m/z152.0110 [M-H-·CH3]-、122.9337 [M-H-CO2]-和108.0225 [M-H-CH3-CO2]-。结合以上信息，最终鉴定该化合物为香草酸（41）。结合文献[38]参考质谱数据，对香豆酸（45）中的片段m/z119.0471 [M-H-CO2]-是由于损失一分子甲基产生的。反式阿魏酸（49）在m/z117.0324处的特征产物离子表明分子中羧基[HCOOH]-的损失。没食子酸（36）二级谱图显示m/z125.0242处有典型的子离子，对应CO2的损失。结合文献[49]鉴定，化合物66为芥子酸，其正离子准分子离子峰为m/z225.075 [M＋H]＋，碎片离子为m/z119.0488 [M＋H-CH3COOH-H2O]＋。

2.2.4 非挥发性组分差异

如图5、6和表2所示，南康组特有的非挥发性组分有4 个：催吐萝芙木定（88）、5-phenyl-3-[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxypentanoic acid（111）、2-acetoxy-4-pentadecylbenzoic acid（138）、1-palmitoyl-lysophosphatidylcholine（139）；瑞金组特有的非挥发性组分有4 个：甲硫腺苷（47）、Lactarorufin B（73）、rac-橙皮素（90）、1-(9Z,12Z,15Zoctadecatrienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine（133）；信丰组特有的非挥发性组分有6 个：榼藤子苷（43）、deoxyphomalone（51）、栀子苷b（60）、矢车菊-3-O-2G-葡萄糖芸香糖苷（63）、桉脂素（108）、2-(beta-D-glucopyranosyloxy)-7-(alpha-L-rhamnopyranosyloxy)-5-hydroxy-4′-methoxyflavone（116），安远、南康、瑞金、信丰的共同非挥发性组分有102 个。

表2 采用UPLC-QTOF-MS的脐橙的非挥发性成分鉴定Table 2 Information about non-volatile compounds of navel oranges identified by UPLC-QTOF-MS

图5 采用UPLC-QTOF-MS方法得到脐橙果肉总离子流图Fig.5 Total ion current chromatograms of volatile components of

图6 采用UPLC-QTOF-MS方法得到脐橙非挥发性成分Venn图Fig.6 Venn diagram of non-volatile components of navel oranges identified by UPLC-QTOF-MS

3 结论

本研究通过联合HS-SPME-GC-MS和UPLC-QTOFMS对赣南脐橙的化学成分进行分析。采用HPLC-QTOFMS方法，通过对其代谢物进行提取和分析，分别在正离子模式和负离子模式下采集数据，比对数据库和文献鉴定非挥发性化合物148 种。其中黄酮类化合物54 种、有机酸20 种、糖苷类化合物20 种、氨基酸14 种、酚酸类化合物12 种、其他类28 种。采用HS-SPME-GC-MS结合NIST 17数据库对97 种挥发性化合物进行鉴定，这些化合物包括46 种烯烃类（包含40 种萜烯）、醇类13 种、醛类12 种、萜类9 种、羧酸6 种、酮类4 种、脂类4 种、酯类2 种、芳香烃1 种。本研究检测到的化合物不仅为赣南脐橙的潜在应用提供科学依据，而且为赣南脐橙的进一步开发提供基础，具有一定的指导意义。