热处理香榧种子油中美拉德产物的生成及其对两种总酚测定方法的影响

许晓君，罗 凡，方学智，杜孟浩，胡立松，龙奇志，钟海雁

（1.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 杭州 311400；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

酚类物质可清除或减少自由基、螯合过渡金属离子、抑制氧化应激酶活性并促进抗氧化剂发挥作用，具有抗氧化和抗癌等功效[1]，是植物油等食品中的功能活性成分之一，也是维持油脂氧化稳定性的关键成分。目前酚化合物的测定主要基于分光光度法、光谱法、比色法、酶法、电化学法和色谱技术等，其中基于分光光度法的福林-酚法在总酚测定中应用广泛。福林-酚法测定总酚的基本原理是：在碱性条件下，福林-酚试剂（磷钼酸-磷钨酸）被酚羟基还原，生成蓝色化合物，后者在碱性环境中可被氧化成醌类化合物，该物质在765 nm波长处可被紫外-可见分光光度计检出[2]。由于福林-酚法操作简单且反应迅速，橄榄油[3]、葵花籽油[4]、花生油[5]及茶油[6]等植物油的总酚定量多采用该法进行。然而，该法选择性较差，试样中除酚化合物外的蛋白质、氨基酸、糖类、不饱和脂肪酸、维生素、醛、酮等物质都可能会干扰测定结果。Kanzler等[7]发现美拉德反应的中间产 物——二羰基化合物具有还原福林-酚试剂的潜力，但目前针对活性美拉德产物干扰植物油总酚含量及方法改良的研究尚少。

研究[8-9]发现固蓝BB盐（fast blue BB，FBBB）的重氮基团与带活性羟基的芳香环可耦合生成稳定的偶氮衍生物，该物质在420 nm波长处可被紫外-可见分光光度计检出，由此开发出了一种新的酚化合物定量方 法——FBBB法。基于该法的测定原理，食品基质中VC和还原糖等物质的存在不会对总酚定量造成干扰，说明FBBB法的选择性更优、定量准确可靠。Nowak[10]和López-Froilán[11]等的研究结果皆证实了FBBB法不受VC干扰的观点，发现了该法在水果饮料总酚测定上的应用潜力。Lester等[12]在测定添加了VC和果葡糖浆饮料的总酚时发现，FBBB法测得的没食子酸当量值高于福林-酚法，体现了FBBB法测定总酚的高灵敏度。Pico等[13]比较了两法在豆类、谷物、水果、坚果和植物种子的总酚测定中受干扰的程度，发现FBBB法不易受影响。然而，目前FBBB法主要应用于水相基质的总酚测定中，Siano等[14]研究了FBBB法直接测定不同橄榄油总酚的可能性，发现相较于福林-酚法，FBBB法的测定结果更接近于液相色谱法，但该法在其他食用植物油中的应用研究仍有欠缺。

香榧籽是红豆杉科榧属常绿乔木香榧（Torreya grandiscv.Merrilli）的果实，其含油率高且油脂的营养和活性成分丰富、经济价值高。热处理是香榧种子油制备工艺中必不可少的加工环节，不仅可以降低水分还可以提高出油率并赋予油脂特征风味。Shi Longkai等[15]还发现热压香榧种子油比冷压油具有更强的抗氧化能力。

本研究以分析两种方法（福林-酚法与FBBB法）在测定相同热预处理香榧种子油总酚时存在差异的原因为切入点，通过测定油脂褐变指数及3-脱氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）、丙酮醛（methylglyoxal，MGO）和5-羟甲基糠醛（5-(hydroxymethyl)furfural，5-HMF）3 种常见美拉德产物含量验证美拉德反应的发生，随后进一步考察3 种产物对福林-酚法和FBBB法测定总酚的影响，为美拉德产物对福林-酚法测定油脂中总酚的影响研究提供依据，也为总酚测定方法的科学选择提供一定支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香榧籽购自杭州富阳洪鑫农业开发有限公司，经自然晾干后置于鼓风干燥箱内，分别在0、60、90、120、150 ℃加热0、30、60、90、120 min后取出。冷却、脱壳后液压制油，香榧种子油经过滤后于4 ℃贮藏备用。

福林-酚试剂、MGO（纯度98%）、邻苯二胺（纯度99.5%）上海麦克林生化科技有限公司；FBBB、没食子酸（纯度99%）、5-HMF（纯度98%）美国Sigma-Aldrich公司；3-DG（纯度75%）加拿大Toronto Research Chemicals公司；正己烷、甲醇（均为色谱纯）、冰醋酸（分析纯）、碳酸钠、氢氧化钠 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；源丰液压榨油机 洛阳市佳源机械有限公司；S-114电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；XW-80A旋涡混合仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；UV-2550紫外分光光度计 日本岛津 公司；Q-101平行蒸发仪 瑞士Büchi公司；V-500多管真空固相萃取装置、LC-10AT型液相色谱系统（配有可变波长紫外检测器和CDS A.02.19色谱工作站）美国 安捷伦公司；二醇基固相萃取柱（500 mg，3 mL）美国Agela公司；有机相针式滤器（13 mm，0.22 μm）上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香榧种子油总酚的提取与测定

1.3.1.1 香榧种子油总酚提取液的制备

参考Flores等[16]的方法并略作修改。用10 mL甲醇和10 mL正己烷先后淋洗二醇基固相萃取柱，活化后备用。分别称取2 g不同加热条件所制香榧种子油（1.1节）溶于5 mL正己烷中，混合均匀后过已活化的二醇基固相萃取柱，用10 mL正己烷过柱清洗后再用10 mL甲醇洗脱固相萃取柱。收集洗脱液，于40 ℃蒸干，用50%甲醇复溶后得香榧种子油总酚提取液。

1.3.1.2 福林-酚法测定总酚

参考Huang Zhiting等[17]的方法并略作修改。取1 mL 1.3.1.1节中制备的香榧种子油总酚提取液，加入0.5 mL福林-酚试剂，反应3 min后加入1 mL 20%碳酸钠溶液，定容至10 mL后显色90 min，于765 nm波长处测定吸光度。以没食子酸为标准样品绘制标准曲线，总酚含量以每克样品中没食子酸当量表示（μg/g）。

1.3.1.3 FBBB法测定总酚

参考Medina[9]的方法并略作修改。取1 mL 1.3.1.1节中制备的香榧种子油总酚提取液，加入8 mL去离子水与0.5 mL 0.1% FBBB试剂，充分混合后加入0.5 mL 5%氢氧化钠溶液，混匀后显色90 min，于420 nm波长处测定吸光度。以没食子酸为标准样品绘制标准曲线，总酚含量以每克样品中没食子酸当量表示（μg/g）。

1.3.2 香榧种子油褐变指数与美拉德产物的测定

1.3.2.1 褐变指数测定

参考Zhang Nana等[18]的方法并略作修改。分别称取0.5 g不同预热条件所制香榧种子油，用正己烷（1∶10，g/mL）溶解稀释，分别于294、420 nm波长处测定吸光度。

1.3.2.2 3-DG、MGO测定

参考杨楠等[19]的方法并略作修改。分别称取0.5 g不同加热条件所制香榧种子油，用甲醇萃取3 次后定容至10 mL得美拉德产物提取液，冷藏备用。取2 mL美拉德产物提取液与1 mL 0.25 mg/mL的邻苯二胺溶液混合，用氢氧化钠溶液调节体系pH值至9后置于60 ℃水浴锅中反应4 h，衍生处理样液过0.45 μm滤膜后应用高效液相色谱仪测定。标准品溶于甲醇后的处理与测定同上。

色谱条件：ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱温40 ℃；进样量10 μL；流速0.8 mL/min；流动相：A为0.1%冰醋酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0.01～15 min，72%～57% A、28%～43% B；15.01～31 min，57%～25% A、43%～75% B；31.01～38 min，25%～72% A、75%～28% B；38.01～60 min，72% A、28% B；紫外检测器；检测波长314 nm。

1.3.2.3 5-HMF测定

取2 mL 1.3.2.2节所制备的美拉德产物提取液，过0.45 μm滤膜后应用高效液相色谱仪测定。标准品溶于甲醇后的处理与测定同上。

色谱条件：ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；柱温40 ℃；进样量10 μL；以50%甲醇溶液为流动相；洗脱时间15 min；流速0.7 mL/min；紫外检测器；检测波长280 nm。

1.3.3 美拉德产物对总酚测定的影响

1.3.3.1 福林-酚法、FBBB法测定3-DG、MGO及5-HMF溶液

用甲醇分别溶解MGO、3-DG和5-HMF，配制成质量浓度梯度为0、42.4、84.8、127.2、169.6、212 μg/mL的溶液，分别替代1.3.1.2、1.3.1.3节中的总酚提取液进行福林-酚法与FBBB法的总酚测定。

1.3.3.2 3-DG的存在对没食子酸溶液总酚测定的影响

3-DG对不同质量浓度没食子酸溶液总酚测定的影响：配制100 μg/mL 3-DG甲醇溶液，分别与0、40、80、100、160、200、300 μg/mL没食子酸溶液等体积混合，配制成不同质量浓度比（没食子酸∶3-DG＝0～3）的复合溶液。将复配溶液分别替代1.3.1.2、1.3.1.3节中的总酚提取液进行福林-酚法与FBBB法的总酚测定。

不同质量浓度3-DG对没食子酸溶液总酚测定的影响：配制100 μg/mL没食子酸甲醇溶液，分别与0、20、50、100、200、300、500、600 μg/mL 3-DG甲醇溶液等体积混合，配制成不同质量浓度比（3-DG∶没食子酸＝0～6）的复合溶液备用。将复配溶液分别替代1.3.1.2、1.3.1.3节中的总酚提取液进行福林-酚法与FBBB法的总酚测定。

1.4 数据处理

实验数据为3 次重复平均值。分别采用Microsoft Excel 2010软件与Origin Pro 9.1软件进行数据处理与作图，使用SPSS 21.0软件对数据进行差异显著性分析（P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 加热处理对香榧种子油总酚含量的影响

图1A显示，福林-酚法测定下，香榧籽在60 ℃与120 ℃处理60～90 min、150 ℃处理时间超过60 min时，油样中总酚含量显著升高（P＜0.05），这与罗凡等[20]对油茶籽油的研究结果一致。一些酚类物质往往与蛋白质结合，加热条件下蛋白质可能发生变性，导致这部分结合酚释放[21]；还可能是因为加热抑制了脂氧合酶的活性，减少了自由基的生成，从而延缓了酚含量的下降。除上述原因外，香榧籽加热引发美拉德反应产生的某些还原性物质可能参与酚类物质和福林-酚试剂的反应导致总酚测定结果偏大。与未经热处理香榧种子油相比，加热引起油样中总酚含量普遍下降，最大降幅为67%（60 ℃、120 min）。这可能是因为酚类物质具有热不稳定性，高温破坏羟基酸等物质的结构，造成总体含量下降[22]；还可能与还原性美拉德产物发生降解，而降解产物不具有还原酮等抗氧化基团结构[23]有关。

图1 福林-酚法（A）、FBBB法（B）测定热处理香榧种子油的总酚含量Fig.1 Total phenolic contents of heat-treated Torreya grandis cv.Merrilli seed oil determined by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

图1B显示，FBBB法测定中，香榧籽在150 ℃热处理90～120 min时，总酚含量随加热时间的延长显著减小（P＜0.05），这与相同条件下福林-酚法的测定结果相反，该差异可能与美拉德产物对两法的干扰程度不同有关。多数美拉德产物不具有带活性羟基的芳香环结构，无法与FBBB试剂的重氮基团耦合生成稳定的偶氮衍生物，FBBB法不受这类美拉德产物的干扰。此外，还发现采用两种方法测定相同的酚提取液，FBBB法测得的没食子酸当量值总体高于福林-酚法，这与Lester等[12]的研究结果一致，可能与没食子酸在不同反应体系中的响应存在差异有关。

2.2 热处理香榧种子油中美拉德产物的测定

2.2.1 加热处理对香榧种子油褐变指数的影响

图2A显示，在294 nm波长处，相同预处理时间下香榧种子油的吸光度总体随加热温度的升高而增大。低温（60、90 ℃）预处理下，90 min后香榧种子油在294 nm波长处的吸光度明显增大；而在高温（120、150 ℃）预处理下，香榧种子油的吸光度更早地开始逐步升高，表明低温长时热处理及高温处理皆会促进美拉德中间产物的形成。Haase等[23]的研究也发现温度改变会显著影响二羰基化合物等美拉德中间产物的形成和积累。图2B显示，在420 nm波长处，60 ℃低温下香榧种子油吸光度随加热时间的延长变化不显著（P＞0.05），经90 ℃处理油脂在加热60 min后吸光度显著升高（P＜0.05），而在120、150 ℃油脂吸光度升高的时间点皆有所提前，分别为30 min和0 min。此外，油脂在90、120 ℃下加热超过90 min后吸光度显著下降（P＜0.05），这可能与长时热处理下美拉德产物的降解速率大于生成速率有关。150 ℃高温处理下，香榧种子油的吸光度在加热超过60 min后持续升高，推测有美拉德反应终产物大量形成。上述现象表明，对香榧籽进行一定程度的热处理会促进油脂中美拉德产物的形成，且其浓度受加热温度和时间的影响。

图2 不同热处理香榧种子油在294（A）、420 nm（B）波长处的吸光度Fig.2 Absorbance at 294 (A) and 420 nm (B) of heat-treated T.grandis cv.Merrilli seed oil

2.2.2 热处理香榧种子油中3-DG、MGO及5-HMF的测定

课题组前期研究已发现在经二醇基小柱萃取所得的总酚提取液中有多种美拉德产物的存在。因此对不同温度、时间预处理香榧种子油中3-DG、MGO及5-HMF的含量进行测定并计算其在总酚提取液中的质量浓度，如表1所示。

表1 不同热处理香榧种子油中3-DG、MGO及5-HMF的含量及其在 酚提取液中的质量浓度Table 1 Contents of 3-DG,MGO and 5-HMF in heat-treated T.grandis cv.Merrilli seed oil and concentrations of 3-DG,MGO and 5-HMF in phenolic extract from the oil

MGO是活性C6-α-二羰基化合物裂解形成的短链α-二羰基化合物[24]，在各加热条件的香榧油样中皆有检出，含量范围为0.67～1.73 μg/g，略高于同条件下油茶籽油[25]中检出的MGO含量，这可能与不同油料种子中糖类与氨基酸的组成与含量存在差异、MGO前体物质的积累等因素有关。3-DG属于二羰基类化合物，是影响食品基质中美拉德产物组成的重要前体物质[26-27]，5-HMF是其主要降解产物[28]。两种物质仅在经150 ℃热处理的油样中检出，且含量随加热时间的延长而不断增加，含量范围分别为0.21～0.47、0.06～0.40 μg/g，这可能是因为适当提高加热强度能促进3-脱氧半乳糖等同类二羰基化合物向3-DG转化[29]；还能加速糖类物质的脱水或同质异构化，促进了5-HMF的产生。上述结果表明，在本实验条件下，香榧种子中的3-DG或同类活性二羰基化合物主要裂解形成了短链α-二羰基化合物，而在高温长时下还会发生降解，产物经榨油工艺转移至香榧种子油中。

2.3 美拉德产物对总酚测定的影响

2.3.1 美拉德产物对福林-酚法及FBBB法测定总酚的影响

图3A显示，在0～212 μg/mL质量浓度范围内，福林-酚法测定下3-DG组的吸光度随质量浓度增大呈线性升高（相关系数（R2）＝0.998），且在765 nm波长处的响应强于其他两组。MGO组的吸光度虽随质量浓度增大呈线性升高（R2＝0.966），但升高幅度不大，说明α-二羰基化合物及其复合物解聚后还原能力减弱。5-HMF 组的吸光度随质量浓度增大变化不显著（P＞0.05），表明α-二羰基化合物降解后基本失去对福林-酚试剂的还原能力。结果表明，MGO和3-DG的存在会对福林-酚法测定样品总酚造成一定的干扰，且3-DG的影响最大，而5-HMF的影响不明显。图3B显示，在相同质量浓度范围内，FBBB法测定下3 种美拉德产物在420 nm波长处测得的吸光度变化不显著（P＞0.05）。结合2.2.2节中3-DG、MGO分别在150 ℃油样、所有油样中检出，图1中两法在150 ℃、90 min后总酚测定结果的差异可能与MGO和3-DG的存在对福林-酚法的干扰有关，但由于两种产物在香榧种子油总酚提取液中浓度较低，其对测定的干扰程度仍有待探究。

图3 3 种美拉德产物对福林-酚法（A）、FBBB法（B）测定总酚的影响Fig.3 Effects of three MRPs on the quantification of total phenolics by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

2.3.2 3-DG对总酚测定的影响

2.3.1 节的研究结果表明，3 种美拉德产物中3-DG对福林-酚法测定样品总酚的影响最大，进一步考察该物质对不同质量浓度没食子酸体系总酚测定的影响及其质量浓度变化对两种总酚测定方法的干扰，结果分别如 图4、5所示。

图4 3-DG对福林-酚法（A）、FBBB法（B）测定不同质量浓度 没食子酸体系总酚的影响Fig.4 Effects of 3-DG on the quantification of total phenolics in gallic acid systems by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

图4显示，在两法测定下，单一组和复合组的总酚含量与没食子酸质量浓度线性关系均良好，福林-酚法R2分别为0.997和0.995，FBBB法R2分别为0.989和0.996。相同没食子酸添加质量浓度下福林-酚法测定复合组总酚含量高于单一组，测定差值随没食子酸质量浓度变化差异不显著（P＞0.05），表明3-DG的存在会造成福林-酚法测定结果偏大且干扰程度与样品总酚含量无关，样品中总酚含量越低，测定结果误差越大。此外，福林-酚法对两组总酚的测定差值大于FBBB法，说明3-DG对前者的影响较大，该发现与2.3.1节的研究结果一致。因此，针对鹰嘴豆[30]、燕麦[31]及植物油[32]等这类加工过程可能经历膨化、焙烤及热预处理等工艺而总酚含量又相对较低的食品，选择FBBB法进行总酚定量可有效减小因美拉德产物存在而引起的误差。

图5A显示，添加3-DG质量浓度不小于25 μg/mL情况下，福林-酚法测定复合组的总酚含量显著大于没食子酸组（P＜0.05），且随着3-DG质量浓度的增大，总酚含量呈线性增大趋势（R2＝0.998），表明3-DG对该法测定总酚的影响具有浓度依赖性。Nederal等[33]研究发现，南瓜籽经加热后榨取的油脂中美拉德活性产物浓度与总酚含量提升明显，并将后者归因于结合态酚向游离态酚的转变；本研究结果说明，该现象还可能与美拉德活性产物引起福林-酚法定量误差有关。图5B显示，FBBB法测定下，随着3-DG质量浓度的增大，复合组的总酚含量与没食子酸组相比皆无显著变化（P＞0.05），表明在此实验体系下3-DG质量浓度改变对FBBB法的干扰有限。

图5 3-DG质量浓度变化对福林-酚法（A）、FBBB法（B）测定总酚的影响Fig.5 Effect of 3-DG concentration on the quantification of total phenolics by Folin-Ciocalteu (A) and Fast Blue BB assays (B)

3 结论

香榧籽在150 ℃热处理90～120 min时，福林-酚法测得油脂总酚含量上升，而FBBB法测定结果与之相反。对香榧种子油褐变指数进行测定，发现低温长时热处理及高温处理皆会引起香榧种子油在294 nm波长处吸光度上升，指示美拉德中间产物的形成。在经高温（150 ℃）处理的油样中检出了3-DG（0.21～0.47 μg/g）与5-HMF（0.06～0.40 μg/g），在各预热条件的油样中皆检出了MGO（0.67～1.73 μg/g）。进一步考察3 种美拉德产物对两种方法测定总酚的影响时发现，福林-酚法测定下3-DG、MGO在765 nm波长处的吸光度皆随质量浓度增大呈线性升高，同质量浓度3-DG、MGO与5-HMF在此波长处的响应排序为3-DG＞MGO＞5-HMF，3-DG的存在会造成福林-酚法测定结果偏大且干扰程度与样品总酚含量无关，而与其本身质量浓度呈正相关；FBBB法测定下，3 种美拉德中间产物在420 nm波长处的吸光度变化皆不显著。因此，针对加工过程中易形成3-DG、MGO的食品基质，选择FBBB法替代福林-酚法测定总酚可降低这两种物质对定量的干扰。