生食蔬菜源金黄色葡萄球菌毒素编码基因和药敏性分析

白小宝，索 佳，曹晨阳，苏 丽，赵越凡，刘丽莎，冯承谦，吕 欣，杨保伟,

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.国家食品安全风险评估中心，北京 100022；3.汉中市汉台区市场监督管理局过街楼蔬菜批发市场监管所，陕西 汉中 723000）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性致病菌，广泛分布于环境、动物和人体[1-2]。2016年，金黄色葡萄球菌及其肠毒素引起的食源性疾病暴发事件仅次于副溶血性弧菌和沙门菌[3]。随着抗生素的长期使用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcus aureus，MRSA）和苯唑西林敏感耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（oxacillin-susceptible methicillin-resistantStaphylococcus aureus，OS-MRSA）日渐流行，给食品安全带来极大危害[4-6]。

新鲜生食蔬菜可提供人体必需的维生素和矿物质等多种营养，为日常饮食中不可或缺[7]。此类蔬菜经常以生食为主，进食前往往不经高温烹饪，被金黄色葡萄球菌及其肠毒素污染后非常容易导致食物中毒[8]。随着MRSA和OS-MRSA日渐流行，其对食品安全构成的潜在风险日益加剧[8-10]。

目前，针对生食蔬菜中致病菌的研究主要集中于沙门氏菌和大肠杆菌[7]，对金黄色葡萄球菌污染深入研究较少[11-15]。本研究对前期分离于陕西4 个城市大型超市、农贸市场和摊贩的西红柿、生菜、菠菜和包菜的金黄色葡萄球菌进行相关研究，旨在为生食蔬菜中金黄色葡萄球菌的安全控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

27 株疑似金黄色葡萄球菌，分离于2020年9月—2021年9月在陕西西安、宝鸡、汉中和延安大型超市、农贸市场和摊贩采集的西红柿、生菜、菠菜和包菜。药敏实验质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。

1.1.2 试剂

LB（Luria-Bertani）琼脂培养基 北京陆桥技术股份有限责任公司；TaqDNA聚合酶、10×聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Buffer、dNTP Mixture、MgCl2、DL2000 DNA Marker、Loading Buffer、Gel Red 大连宝生物工程有限公司；14 种 抗生素 北京索莱宝科技有限公司；引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2 仪器与设备

PCR仪、GEL-DOCXR凝胶成像系统 美国伯乐 公司；SW-CJ-1CU超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；Milli-Q Synthesis超纯水机 德国默克密理博 公司；微量移液枪 德国艾本德股份公司；GNP-9080隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；MDF-U5411高压灭菌锅 上海申安高压仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR模板制备

将保存于-80 ℃的疑似菌划线接种至LB琼脂平板，37 ℃培养过夜后，挑取典型菌落再次划线至LB；挑取1～2 个菌落，均匀分散于200 μL无菌去离子水，用煮沸法制DNA模板。

1.3.2nuc、毒素和耐药性编码基因检测

使用PCR扩增nuc基因鉴定金黄色葡萄球菌。阳性菌株通过PCR扩增5 种经典肠毒素编码基因sea、seb、sec、sed和see，13 种新型肠毒素编码基因seg、seh、sei、sej、sek、sem、sen、seo、sep、seq、ser、set和seu，杀白细胞毒素编码基因pvl共19 种基因；扩增大环内酯类抗生素耐药性编码基因ermA、ermB、ermC和msrA，四环素耐药编码基因tetK，氨基糖苷类抗生素耐药编码基因aac(6′)/aph(2″)，甲氧苄啶耐药性编码基因dfrD、dfrK、dfrG和dfrS1(dfrA)，β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因blaZ和mecA等。

根据文献[16-19]报道的序列合成引物。PCR体系为25 μL，其中10×buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、dNTP 2 μL、Taq酶0.25 μL、上游引物0.3 μL、下游引物0.3 μL、超纯水13.15 μL和模板DNA 5 μL。

1.3.3 抗生素药敏性检测

采用临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）颁布的琼脂稀释法，测定27 株菌对14 种抗生素的敏感性。供试抗生素及其耐药折点分别为：红霉素（erythromycin，ERY；8 µg/mL）、氨苄西林（ampicillin，AMP；0.5 µg/mL）、阿莫西林/克拉维酸（amoxicillin/clavulanic acid，A/C；8/4 µg/mL）、苯唑西林（oxacillin，OXA；4 µg/mL）、头孢西丁（cefoxitin，FOX；8 µg/mL）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP；4 µg/mL）、利福平（rifampin，RIF；4 µg/mL）、万古霉素（vancomycin，VAN；16 µg/mL）、四环素（tetracycline，TET；16 µg/mL）、庆大霉素（gentamicin，GEN；16 µg/mL）、氯霉素（chloramphenicol，CHL；32 µg/mL）、阿米卡星（amikacin，AMK；64 µg/mL）、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（trimethoprim/sulfamethoxazole，T/S；4/76 µg/mL）和头孢曲松（ceftriaxone，CRO；64 µg/mL）。

1.4 数据统计及图表绘制

采用Excel 2016软件进行数据统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌检出

经nuc鉴定，27 株疑似金黄色葡萄球菌均为金黄色葡萄球菌，在各种生食蔬菜中的流行情况不同。其中，10 株（37.0%，10/27）菌mecA阳性，全部对OXA敏感，均为OS-MRSA菌株（表1）。17 株（63.0%，17/27）菌为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin susceptibleStaphylococcus aureus，MSSA）。

表1 MSSA和OS-MRSA在生食蔬菜中的流行状况Table 1 Prevalence of MSSA and OS-MRSA in vegetables consumed raw

2.2 毒素编码基因检出

在19 种供试毒素编码基因中共检出sea、seb、sec、seh、sek、sem、sen、seq8 种。其中，sec检出率最高（29.6%，8/27），其次分别为seb和sek（22.2%，6/27），seh（11.1%，3/27），sea、sen和seq（7.4%，2/27），sem（3.7%，1/27）。未检出sed、see、seg、sei、sej、seo、sep、ser、set和seu等肠毒素编码基因和杀白细胞毒素基因pvl（表2）。

表2 生食蔬菜中金黄色葡萄球菌毒素编码基因检出率Table 2 Detection rates of toxin-encoding genes in S.aureus isolate from vegetables consumed raw

51.9%（14/27）的分离株至少携带1 种毒素编码基因，共检出9 种毒素编码基因谱。其中，seb-sec-sek（11.1%，3/27），sec、sec-seh和seb-sek-seq（7.4%，2/27），sea、sen、sea-seh、seb-sek和sec-sem-sen（3.7%，1/27）比较常见（表3）。

表3 生食蔬菜中金黄色葡萄球菌毒素编码基因谱Table 3 Profiles of toxin-encoding genes in S.aureus isolates from vegetables consumed raw

2.3 药敏性检测

27 株金黄色葡萄球菌全部对OXA、RIF和VAN敏感。对A/C耐受最为普遍（100.0%，27/27），其次分别为T/S（96.3%，26/27），AMP（92.6%，25/27），ERY（74.1%，20/27），FOX（40.7%，11/27），CIP（22.2%，6/27），CRO（14.8%，4/27），GEN（11.1%，3/27），AMK和TET（7.4%，2/27），CHL（3.7%，1/27）（表4）。

表4 生食蔬菜中金黄色葡萄球菌耐药率Table 4 Drug resistance rates of S.aureus isolates from vegetables consumed raw

27 株分离株共呈现出12 种耐药谱（表5）。最常检出的耐药谱为AMP-FOX-ERY-A/C-T/S（29.6%，8/27），其次分别为AMP-ERY-A/C-T/S（14.8%，4/27），AMP-A/C-T/S和AMP-CIP-ERY-A/C-T/S（11.1%，3/27），A/C-T/S（7.4%，2/27），AMP-A/C、AMP-CIP-A/C-T/S、AMP-CRO-ERY-A/C-T/S、AMP-FOX-CIP-ERY-A/C-T/S、AMP-FOX-GEN-TETCRO-ERY-A/C-T/S、AMP-FOX-CIP-GEN-AMK-CROERY-A/C-T/S和AMP-CHL-GEN-TET-AMK-CROERY-A/C-T/S（3.7%，1/27）。

表5 生食蔬菜中金黄色葡萄球菌的耐药谱Table 5 Antibiotic resistance spectrum of S.aureus from vegetables consumed raw

菌株对β-内酰胺类抗生素的耐药表型和基因型基本一致，对大环内酯类、四环素类和氨基糖苷类抗生素的耐药表型和基因型检出不一致（图1）。

图1 金黄色葡萄球菌耐药表型和基因型相关性分析Fig.1 Correlation between antibiotic-resistant phenotypes and genotypes of S.aureus

2.4 耐药基因检出

在12 种供试耐药性编码基因中共检出blaZ、mecA、ermC、tetK、dfrG、dfrK、aac(6′)/aph(2″)7 种基因。其中，blaZ检出最高（88.9%，24/27），其次分别为mecA（37.0%，10/27），ermC（25.9%，7/27），tetK（18.5%，5/27），dfrG和dfrK（14.8%，4/27），aac(6′)/aph(2″)（3.7%，1/27）（表6）。

表6 生食蔬菜中金黄色葡萄球菌耐药基因检出率Table 6 Detection rates of antibiotic resistance-encoding genes in S.aureus from vegetables consumed raw

88.9%（24/27）的分离株至少携带1 种耐药基因。27 株分离株中共检出9 种耐药基因谱，其中blaZ和blaZmecA（22.2%，6/27）最为常见，其次分别为ermCblaZ和dfrK-dfrG-blaZ（11.1%，3/27），tetK-blaZ-mecA（7.4%，2/27），ermC-tetK-blaZ、ermC-dfrK-dfrGblaZ、ermC-tetK-blaZ-mecA和ermC-tetK-aac(6′)/aph(2″)-blaZ-mecA（3.7%，1/27）（表7）。

表7 生食蔬菜中金黄色葡萄球菌耐药性编码基因谱Table 7 Drug resistance gene profiles of S.aureus from vegetables consumed raw

3 讨论与结论

新鲜蔬菜含有糖类、蛋白质、矿物质、维生素、纤维素等多种营养成分，是人们膳食的重要组成部分，规律地摄入蔬菜可以防治肿瘤、心血管疾病和降低 血脂[7,20]。在中国居民膳食平衡宝塔（2022）中，第2层为蔬菜和水果类，蔬菜每日应摄入量为300～500 g[21]。随着人们生活水平的提高，近年来对蔬菜、特别是生食蔬菜的消费量持续增加。因此，生食蔬菜的食用安全性尤为重要。目前，已有在生食蔬菜中检出金黄色葡萄球菌的报道[8,15,22]。

为更好掌握陕西省生食蔬菜中金黄色葡萄球菌的流行状况及其基本特性，本研究对历时13 个月，从省内4 个地区大型超市、农贸市场和摊贩采集的西红柿、生菜、菠菜和包菜中分离出的27 株金黄色葡萄球菌的药敏性、耐药基因和毒素基因进行了研究。对27 株金黄色葡萄球菌的mecA基因和OXA敏感性检测结果表明OS-MRSA菌株占37.0%（10/27）。张鹏飞等[4]在生猪养殖场分离到的OS-MRSA占金黄色葡萄球菌的13.4%（9/67），Zhang Pengfei等[23]在184 株零售食品源金黄色葡萄球菌中检出7 株（3.8%）OS-MRSA。本研究发现生食蔬菜中OS-MRSA的检出率高于生猪养殖场和零售食品。OS-MRSA菌株携带mecA，有可能在抗生素选择下变为高度耐药的MRSA变种[24-25]。蔬菜生产产业链主要包括种植、运输、贮藏、加工或直接销售等环节，任一环节都可能受到金黄色葡萄球菌的污染[7,13,26]。在种植地，蔬菜可能会被携带金黄色葡萄球菌的粪便和灌溉水直接或间接污染[7,13]。蔬菜从种植地采收、被运输到大型超市、农贸市场和摊贩过程中，包装不严、运输车辆、用具和人员被金黄色葡萄球菌污染等也均可导致蔬菜污染[7,13]。粪便、灌溉水和环境中金黄色葡萄球菌种类繁多，药敏特性各不相同。因此，复杂众多的生产环节均可能导致蔬菜携带较多OS-MRSA菌株。这充分表明，不应忽视蔬菜作为食品载体进一步传播OS-MRSA的可能，对蔬菜种植及相关环境中OS-MRSA的存在和演变进行追溯研究非常必要。

本研究发现陕西省蔬菜中51.9%（14/27）的金黄色葡萄球菌携带1～3 种毒素编码基因，sec基因检出率为29.6%，同时也检出了seb和sek（22.2%），seh（11.1%），sea、sen和seq（7.4%），sem（3.7%）等，与肉鸡屠宰加工环节金黄色葡萄球菌seb、sek（18.8%）的检出率比较相似[27]。Wu Shi等[15]在零售蔬菜源金黄色葡萄球菌中也检出了sec（83.3%）、seb（36.7%）、sek（30.0%）、seh（50.0%）、sea（26.7%）、sen（36.7%）、seq（50.0%）和sem（86.7%）等毒素编码基因，但其检出率均高于本研究。检出率的差异可能与分离菌株地理位置和样品类型有关。本研究中几乎一半的分离株携带毒素基因，有9 种毒素编码基因谱，比现制饮品中金黄色葡萄球菌毒素基因检出率（34.9%）高，但比肉鸡屠宰环节（96.9%）低[27-28]。表明蔬菜被肠毒素基因阳性金黄色葡萄球菌污染情况较为严重，可能会对食品安全产生潜在危害。

药敏结果表明，所有菌株对A/C耐药，70%以上的菌株分别对T/S、ERY和AMP耐药，40%左右的菌株对FOX耐药，可耐受2～9 种抗生素。菌株对AMP、CIP和RIF的耐药率与Wu Shi等[15]在零售蔬菜中研究结果相似，对T/S、ERY、CIP和AMP的耐药率与张鹏飞等[27]对肉鸡屠宰环节的研究结果较相近，对A/C和AMP的耐药率高于哈爱日等[29]对内蒙古奶牛乳源中金黄色葡萄球菌的耐药率。分离株呈现出的耐药谱种类多于肉鸡屠宰环节和现制饮品中金黄色葡萄球菌的耐药谱[27-28]。耐受3 种及以上抗生素菌株的检出率（88.9%）也高于即食食品和蔬菜（80.0%）[8]及鸡肉中耐受相同种类抗生素菌株的检出率（65.78%）[18]。蔬菜中金黄色葡萄球菌多重耐药情况非常严重，这可能与抗生素在人类及农业生产中过度使用相关[30-32]。因此，需要严格控制并减少抗生素的使用限制耐药细菌的出现。

综上，在陕西省蔬菜中分离的27 株金黄色葡萄球菌中检出了OS-MRSA，也检出了MRSA。菌株多重耐药情况比较严重，携带多种抗生素编码基因和毒素编码基因。应加强对生食蔬菜中金黄色葡萄球菌的检测和防控，以防止其通过食物链传播，减少由此可能引发的食源性疾病。