基于原噬菌体类型的广西柑橘黄龙病菌种群分析

李战彪　林林　陈锦清等

关键词 广西；柑橘；柑橘黄龙病；原噬菌体；种群类型

中图分类号：S 436.66 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022200

柑橘黄龙病（citrus Huanglongbing，HLB）是柑橘生产上的毁灭性病害，严重影响柑橘产业的健康发展[1]。该病由专性寄生的柑橘韧皮部杆菌属Candidatus Liberibacter引起，目前发现有3个种，分别为亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）、非洲种Candidatus Liberibacter africanus（CLaf）和美洲种Candidatus Liberibacter america-nus （CLam）[1-2]，危害我国柑橘的主要为CLas。在我国HLB最早于20世纪50年代发现于广东省，至今我国的大多数柑橘产区都受到该病的危害，且部分地区受害严重[1，3-6]。广西是我国重要的柑橘产区，柑橘种植面积和产量均居全国前列，黄龙病的肆虐严重制约产业的发展。明确黄龙病在广西的发生、分布并分析黄龙病菌种群类型，对掌握该病的蔓延流行及防控有重要意义。

针对CLas种群多样性的研究大多基于保守的16S rDNA序列、16S/23S rRNA基因间隔区、β操纵子以及外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）基因等染色体区域[7-9]。Subandiyah等[9]通过16S rDNA、16S/23S rDNA間隔区对亚洲多个地区的黄龙病菌进行分析发现其基因变异较小，多样性不显著；谢昌平等[7]对赣南柑橘黄龙病菌的16SrDNA、16S/23S rDNA间隔区和核糖体蛋白基因的遗传多样性进行分析发现，供试的黄龙病菌样品在3个基因片段上的RFLP指纹图谱均一致，未表现出多态性[7]；黄永辉等[10]OMP基因对广东不同地区的柑橘黄龙病菌遗传多样性进行分析未发现显著差异。Puttamuk等[11]利用2个效应因子基因（LasA和LasA）对泰国的柑橘黄龙病菌进行多样性分析发现，LasAn基因的突变率较小。相对于保守的染色体区域，原噬菌体区域由于是噬菌体整合到细菌宿主基因组的DNA片段，具有较高的随机性和变异率，更适于研究CLas种群遗传结构多样性。Tomimura等[12]对东南亚各国不同寄主、不同来源的柑橘黄龙病菌的变异水平研究后发现，相比16S rDNA、16S/23S rDNA间隔区，原噬菌体DNA聚合酶基因更能区分不同国家CLas间的差异；Liu等[13]则通过原噬菌体末端酶基因对我国云南和广东的HLB样品进行分析，发现两省样品中的原噬菌体末端酶基因检出率存在差异；Zhou等[14]利用2个原噬菌体超变异基因对不同地区、不同品种的CLas进行研究，发现不同来源的菌株在该基因上具有高度多态性；黄洪霞等[15]利用原噬菌体区域和短串联重复序列（short tandem repeats，STR）对采自广东省的176个黄龙病样品进行了分析，结果表明基于不同位点和基于所有位点所得到的聚类不同；Fu等[16]对我国南方9省的CLas的原噬菌体类型进行分析发现，南方9省的CLas可根据海拔位置分为两个组群，高海拔的PTG1和低海拔的PTG2，而PTG2又进一步分为PTG2-1和PTG2-2，广西的菌群位于PTG2-2：Zheng等[17]利用原噬菌体、短串联重复序列和微型反向重复转座元件（miniature in-verted-repeat transposable elements， MITEs）对我国南方9省的667份CLas分析后发现，不同基因位点呈现的CLas的遗传多样性存在差异。目前，已鉴定到3种类型的原噬菌体type l（SC1，NC_019549）、type 2（SC2， NC_019550）和type 3（P-JXGC-3，KY661963），且不同的CLas菌株可能携带不同类型或组合的原噬菌体[18-21]。

广西地处热带亚热带地区，气候适宜柑橘类作物生产，也是黄龙病发生较为严重的地区；针对广西柑橘黄龙病的研究多集中在某一品种[22]或不同品种间[23]的黄龙病发病率及16S rDNA的分析上，较少有系统研究其种群的报道。近些年，随着柑橘产业迅速扩张，黄龙病、病毒病等病害呈高发趋势，研究病原菌的种群分化有助于了解病害的发生与流行，进而制定更为有效的防控措施。本研究从广西各地市柑橘种植区采集疑似柑橘黄龙病样品，并对样品进行黄龙病菌和原噬菌体类型的PCR检测，明确HLB在广西的发生分布及黄龙病菌的种群类型，研究结果将为该病的防控提供理论支撑。

1材料与方法

1.1柑橘叶片样品采集

2016年-2021年，从广西壮族自治区南宁市、柳州市、百色市、梧州市等14个地级市的柑橘种植区，采集‘沃柑’‘砂糖橘’‘沙田柚’‘脐橙’‘贡柑’‘黄金柑’‘茂谷柑’‘皇帝柑’‘三红蜜柚’‘脆蜜金橘’‘泰国红宝石青柚’‘越南青柚’等品种疑似黄龙病叶片样品3 293份，保存于-80℃备用。

1.2 DNA提取

取叶片样品100 mg，用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]抽提叶片总DNA。具体操作参照试剂盒说明书进行。最后将DNA沉淀溶解于50μL ddHO中，-20℃保存备用。

1.3黄龙病菌的PCR检测

黄龙病菌的PCR检测引物参考Hocquellet等[24]报道的基于β操纵子基因设计的检测引物（表1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。反应体系如下（总体积20μL）：DNA1μL，10μmol／L上、下游引物各0.5μL，2×TaqMasterMix（Dye）（康为世纪生物科技有限公司）10μL，ddH20 8μL。PCR反应程序：95℃ 5 min;95℃30 s，540C 30 s.72℃30 s，35个循环；72℃10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4基于原噬菌体类型的黄龙病菌检测

黄龙病菌分型引物参考Zheng等[25-26]（表1），引物序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。选取2021年PCR检测为阳性的柑橘叶片总DNA为模板，反应体系如下（总体积10μL）：DNA0.5μL，10μmol／L上、下游引物各0.5μL，2×TaqMaster Mix （Dye）（康为世纪生物科技有限公司）5μL，ddHO 3.5μL。PCR反应程序：95℃ 5 min;95℃30 s，54℃45 s，72℃45 s，35个循环；72℃10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2结果与分析

2.1柑橘样品的PCR检测

利用黄龙病菌特异检测引物对所采集的叶片总DNA进行PCR检测，结果发现，所采集的3293份柑橘叶片样品中有856份样品可扩增出一条大小约为703 bp的目的条带（图1），而健康柑橘样品对照和清水对照则无相应扩增，阳性样品检出率为25. 99%。分别对每年、每个地市样品的检出率进行分析，发现广西壮族自治区内的14个地市均有黄龙病发生，其中，691份样品采集自南宁市，黄龙病阳性样品的检出率为33.29%；同时，通过对2016年一2021年每年的样品检出率进行统计发现，自2016年起，广西各地市黄龙病的检出率呈上升趋势（表2）。

2.2广西柑橘黄龙病菌携带的原噬菌体类型

本研究利用Zheng等[24-25]报道的引物对2021年采集的268份阳性柑橘样品进行了检测，从部分样品中可分别或同时扩增出type 1（目的条带分别为975 bp和866 bp）、type 2（目的条带分别为813 bp和918 bp）、type 3（目的条带分别为950 bp和884 bp）等3种类型的目的PCR条带（图2）。

统计检测结果发现，在268份样品中，67.91%的样品仅能扩增出1种噬菌体类型的目的条带，5.97%的样品可同时扩增出2种或2种以上噬菌体类型的目的条带，部分样品未能扩增出任何噬菌体类型的目的条带。共计存在7种类型的黄龙病菌种群（表3），即仅有type 1菌株，仅有type 2菌株，仅有type 3菌株，type 1+type 2复合菌株，type 2+type 3复合菌株，type 1+type 2+type 3复合菌株，未检出任何类型菌株（none type）；而在这些仅能扩增出一种噬菌体类型的样品中，170份样品能扩增出type 2，表明type 2是广西的优势种群；仅含有type 1和仅含有type 3的菌群只在南宁市发现；复合菌群主要以type 1+type 2（3个），type 2+type 3（2个），type 1+type 2+type 3（11个）3种组合存在，本研究未检测到type 1+type 3类型组合的菌群。其中，南宁市的CLas种群类型最为丰富（表3）。

3结论与讨论

近年来，随着我国柑橘产业的高速发展，广西柑橘种植面积和产量居全国之首，柑橘黄龙病给柑橘产业带来了极大威胁。本研究利用常规PCR对从广西各地级市采集的3293份柑橘（柚类）样品进行了检测，结果发现有856份样品感染了柑橘黄龙病，阳性样品检出率为25.99%，通过对各市阳性样品进行统计发现，各地市的柑橘样品均能检出柑橘黄龙病；而通过对不同年份的黄龙病检出率进行统计发现，2016年—2021年，黄龙病菌的检出率从12.16%逐步上升至46.94%，研究结果显示，柑橘黄龙病在广西的发生有加重的趋势，防控形势不容乐观。

原噬菌体区域具有较高的随机性和變异率，适于研究CLas种群遗传结构多样性，目前，已鉴定到3种类型的原噬菌体type l（SC1，NC_019549）、type 2（SC2，NC_019550）和type 3（P-JXGC-3，KY661963）[19，27]。在我国，存在多种类型的原噬菌体CLas菌株，陈丽芬等[28]在赣南地区的柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama体内发现4种组合的原噬菌体类型菌株，且单一类型的菌株检出率较高；李嘉慧等[21]在我国南方8省区发现7种组合的原噬菌体菌株，type 2类型的检出率最高，是华南地区CLas的优势菌株；崔一平等[20]对广东梅州柑橘主产区CLas的噬菌体类型研究发现，梅州柑橘主产区的CLas大部分含有SC2-1。本研究利用3种类型的原噬菌体分类的特异性引物对广西壮族自治区内CLas的种群类型进行了分析，结果显示，广西区内存在7种类型的CLas菌株，其中，type 2类型的菌株检出率达63.06%，是广西的优势菌株，该结果与李嘉慧等[21]的部分研究结果一致；不同的是，本研究还发现了type 1、type 2+type 3和type 1+type2等3种类型的菌株，但并未发现李嘉慧等报道的type 1+type 3菌株，这可能跟采样地点不同有关。另外，值得注意的是，本研究有较大比例（26.49%）的黄龙病阳性样品中未检出任何类型（none type）的原噬菌体菌株，是位点发生变异还是存在其他类型的原噬菌体菌株，值得深入研究。

基因交流和选择压力是促进种群进化的主要原因。本研究发现广西区内CLas原噬菌体菌株类型多样（7种类型）。近年来广西柑橘产业的迅猛发展，新品种不断引进并大力推广，区域间种苗调运频繁，而苗木带菌则促进了基因交流，不同品种间的选择压力促使种群进化。本研究未能就不同地域间的不同品种上的CLas种群进行研究，但崔一平等[20]研究认为CLas的进化与柑橘品种、小范围内的地域关系不大，但其也发现CLas菌株的进化速度较快，在同一地域的同一果园内存在不同的CLas株系。研究CLas在同一区域不同品种间的进化有助于了解黄龙病的发生流行规律，相关研究仍待进一步加强。

本研究通过6年的采样鉴定发现，柑橘黄龙病已遍布广西各地市，病菌种群结构多样，且类型较为复杂，黄龙病在广西的种群进化等还有待进一步研究。