液相色谱串联质谱检测啶菌唑及其降解产物在土壤和水中的残留

左晗瑜　焦斌　徐军等

关键词 啶菌嗯唑；降解产物；土壤；水；残留检测

中图分类号：S 481.8 文献标识码：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2022322

啶菌噁唑（pyrisoxazole），化学名称为3-[5-（4-氯苯基）-2，3-二甲基-3-异噁唑烷基]吡啶，是我国自主创制的新型噁唑啉类杀菌剂[1]，由沈阳化工研究院于1997年自主研发。其作用机理为抑制病原菌麦角甾醇的生物合成[2]，甾醇14-a脱甲基酶为其作用靶标[3]。啶菌噁唑具有内吸性[4]，兼具保护和治疗作用，能够通过渗透作用进入植物体内并进行传导，杀菌谱广。目前啶菌噁唑已在番茄、黄瓜上取得登记。有研究表明啶菌噁唑对番茄、黄瓜灰霉病的防治效果优于传统杀菌剂如多菌灵、菌核净、嘧霉胺等[5-7]，并且其与传统杀菌剂无交互抗性[7]，可成为传统杀菌剂的有效替代品，同时也可以与其他杀菌剂轮用或者混用，以降低选择压力，延缓病原菌抗性发展，应用潜力极大。

目前关于啶菌噁唑的研究多集中于母体化合物，如杀菌活性测试[8]、药效试验、残留检测和对映体及非对映体层面上的环境行为差异方面[9]。Jiao等[10]应用降解产物预测模型及高分辨质谱相结合的方法研究了啶菌噁唑在水和土壤中的降解行为和降解产物。啶菌噁唑在水中降解主要发生羟基化、羟基氧化、氨基脱保护、异噁唑环开环、脱氨基反应、脱水反应及双键氧化反应。用标准品证实啶菌噁唑在水中的降解产物含有M-274B、M-270、M-254、M-137、M-121和M-119结构。啶菌噁唑在土壤中降解主要发生羟基化、甲基化、氨基脱保护、异噁唑环开环、羟基氧化、脱水反应及双键还原反应。用标准品证实啶菌噁唑在土壤中的降解产物含有M-290、M-274B、M-257结构。

已有文献报道了啶菌噁唑母体在土壤、卷心菜、小白菜、草莓[11]、辣椒、黄瓜[12]和番茄[13]等基质的残留检测方法。但其降解产物的残留分析方法尚未见报道。

近年来，土壤、地表水和地下水中频繁检出残留农药[14-17]，且一些农药在环境中会转化产生活性或毒性更强的降解产物[18]。土壤和水环境中的农药和降解产物残留可以通过食物链富集，最终影响人类健康[19]，因此有必要开展土壤和水环境中农药及其降解产物的残留监测。本研究建立了HPLC-MS/MS同时测定啶菌噁唑及其8种降解产物在土壤和水中的多残留检测方法。该方法简便、准确、灵敏度高，适用于土壤和水中啶菌噁唑及其降解产物的检测。

1材料与方法

1.1药剂与试剂

99.3%啶菌噁唑标准品（CAS： 847749-37-5）购于沈阳化工研究院；降解严物M-119 （95.0%）、M-121（99.0%）、M-137 （97.0%）、M-254 （97.9%）、M-257（98.9%）、M-270 （94.7%）、M-274B （99.4%）、M-290（95.0%）由药明康德公司合成。氯化钠、无水硫酸镁、分析纯乙腈，国药集团化学试剂有限公司；色谱纯乙腈，德国默克公司；弗罗里硅土（ Florisil），购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2仪器与设备

高效液相色谱串联质谱仪HPLC／MS/MS（G6470A），美国Agilent公司；高通量组织研磨仪（CK-2000型），托摩根生物科技公司；电子天平（DT500A，精度±0.1g），江苏常熟常青仪器仪表厂，电子天平（BT25S，精度±0.00001g），德国Sar-torious公司；涡旋混合仪（Vortex-genie 2/2T），美国SI仪器公司；多管涡旋混匀仪（MS200），杭州瑞诚仪器有限公司；台式高速离心机（ Heraeus Mega-fuge 8），美国Thermo公司；超纯水制备系统cio-7003），美国Millipore公司。

1.3试验方法

1.3.1土壤和水樣品采集

土壤样品采集：黑土、红土、水稻土、潮土和褐土，分别采集自黑龙江省大兴安岭地区呼玛县、湖南省长沙县黄花镇鱼塘村、浙江省绍兴市诸暨市店口镇、河北省固安县东位村和山西省运城市平陆县西延村。各种土壤的理化性质见表1。采集地点均未使用过啶菌噁唑。除去土壤中的碎石、杂草和植物根茎等杂物，过2 mm筛，置4℃冰箱保存备用。

水样品采集：选择总有机碳含量（total organic carbon content，TOC）不同的地表水，分别为北京市海淀区辛店河（总有机碳含量为21.4 mg/L）和北京市朝阳区奥林匹克森林公园（总有机碳含量为4.0mg/L）。采集的水样在目标化合物出峰处无干扰，作为空白水样品。

1.3.2前处理方法

土壤样品：称取5.0 g土壤（精度±0.01 g）于50 mL离心管，加入5 mL超纯水浸润样品，涡旋1 min，再加入10 mL乙腈，振荡提取10 min。加入2 g NaCl和2g MgSO，振荡提取5min，4000r／min离心5 min。取上清加入净化小管中（含50 mgFlorisil，150 mg MgSO），涡旋1min，5000r／min离心5 min。用一次性无菌注射器吸取上清液，过0.22μm有机系滤膜，取100μL滤液与900μL超纯水混合，待进样。

水样品：对于降解产物M-119、M-121、M-137的检测，移取10.0mL（精度±0.01 mL）水样，涡旋1min，4000 r／min离心5 min，使用一次性无菌注射器吸取上清液，过0.22μm水系滤膜，待进样。

对于啶菌噁唑及降解产物M-254、M-270、M-274B的检测，移取10.0 mL（精度±0.01 mL）水样，涡旋1min后加入10 mL乙腈，振荡提取5 min，加入4g NaCl，振荡1min，4000r／min离心5min，过0.22μm有机系滤膜。取上清1mL置于2mL离心管氮吹至干，用初始流动相，即100μL色谱纯乙腈及900μL超纯水复溶，待进样。

1.3.3色谱和質谱检测条件

色谱条件：色谱柱采用Poroshell 120 EC-Ci8（2.1 mm×50 mm，1.9μm）；色谱柱温度为40℃；进样量5μL;流动相为0.2%甲酸水（A）和乙腈（B）；流速0. 300

mL/min；洗脱梯度为：0→0.5 min，90% A; 0.5→2.0 min， 90%A→10% A; 2.0→3.0min， 1026A;3.0→3.1 min， 10% A→90% A;3.1→5.0 min，90%A。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式；鞘气温度350℃；鞘气流速11 L/min；干燥气温度350℃；干燥气流速8 L／min;雾化气压力45 psi；喷嘴电压500V；啶菌噁唑及其降解产物的质谱参数如表2所示。

1.3.4标准溶液的配制及标准曲线的制作

用万分之一天平分别称取啶菌噁唑及其降解产物标准品10 mg，置于10 mL容量瓶中，并用色谱纯乙腈定容至10 mL，得到1000 mg/L啶菌噁唑及其各降解产物标准品母液。分别取啶菌噁唑、M-290、M-274B、M-257标准品母液各1mL于10mL容量瓶，用色谱纯乙腈稀释至100 mg/L，得到啶菌噁唑及其在土壤中降解产物的混合标准溶液。按相同的方法制备啶菌噁唑及其在水中降解产物（M-274B、M-270、M-254、M-137、M-121和M-119）的混合标准溶液。各溶液均用锡箔纸包裹，于-18℃避光保存。啶菌噁唑及其土壤降解产物的混合标准溶液用乙腈、空白基质提取液逐级稀释，得到0.05、0.1、0.5、1、5、10μg/L的溶剂标准溶液及基质标准溶液；啶菌噁唑及其水中降解产物的混合标准溶液用乙腈、空白基质提取液逐级稀释，得到0.1、0.5、1、5、10、50μg/L的溶剂标准溶液及基质标准溶液。按照1.3.3节的条件测定。以峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.5添加回收试验

在空白土壤样品中添加适量标准品储备液，使得土壤的3个添加水平分别为1、10、100μg/kg，每种基质每个水平设置5个重复；在空白水样品中添加适量标准品储备液，使得水的3个添加水平分别为0.1、1、10μg/L，每种基质每个水平设置5个重复。按1.3.2节的方法处理，1.3.3节的条件测定，计算平均回收率及相对标准偏差（ RSD）。

2结果与分析

2.1检测条件的优化

本研究选用Poroshell 120 EC-C色谱柱分离目标化合物。在优化液相色谱流动相条件时，分别采用了乙腈-超纯水、乙腈-0.2%甲酸水作为流动相，并采用梯度洗脱法对标准溶液进行进样分析。结果发现加入微量甲酸后不仅峰型更好，而且提高了目标化合物的响应。因此，最终选择以乙腈一0.2%甲酸水溶液作为流动相。采用手动优化建立每个目标化合物的质谱条件，首先利用全扫描模式（MS2 SCAN）寻找目标化合物的母离子，然后利用选择离子监测模式（MS2 SIM）优化锥孔电压，使化合物母离子响应最高，最后在子离子扫描模式（product ion scan）下，使用已优化好的锥孔电压，选择两个稳定存在且响应较高的子离子，优化各自的碰撞能量，使两个子离子响应最高。优化的质谱参数见表2。

2.2提取条件的优化

农药残留分析中常用的有机溶剂有乙腈、丙酮、乙酸乙酯等，乙腈可以溶解并提取各种极性与非极性的农药，提取效率高，被作为QuEChERS前处理方法广泛应用[20-21]，因此本试验选择乙腈作为萃取剂。

一般而言，由于大部分农药偏酸性，乙腈溶液中加入酸可以提高分析物的添加回收率[22-23]。有研究表明[24]，黑土、潮土和水稻土有机质含量较高，加入甲酸能增加部分有机质的溶解度，这些有机质又作为共流出物影响目标化合物的响应。因此，选择纯乙腈作为土壤样品的提取溶剂。

在对水样品进行提取分析时发现，水系滤膜会对啶菌噁唑及其降解产物M-254、M-270、M-274B产生吸附，过膜后，回收率为13%～45%，不满足残留分析的要求，不宜采用直接过0.22μm水系滤膜的方式，故针对这几种化合物采取乙腈提取的方法，而降解产物M-119、M-121、M-137不会被水系滤膜吸附，但采用乙腈提取其回收率不足50%，不满足残留分析的要求，故针对这3种化合物采取直接过0.22μm水系滤膜的方法。即水样品采取直接过0.22μm水系滤膜和乙腈提取两种提取方法。

2.3净化条件的优化

N-丙基乙二胺（PSA）能有效去除基质中的脂肪酸、酚类、碳水化合物等酸性干扰物质以及部分极性色素；C净化剂属于反相吸附剂，可以除去脂类、花青素、蜡类等非极性干扰物质；Florisil主要去除一些极性干扰物及油脂；石墨化炭黑（GCB）主要用来去除色素[24-25]。由于黑土、水稻土、潮土含有大量有机质，故选择了50 mg Florisil、50 mg C和50 mg PSA3种净化方式进行净化。水样品中有机质、色素等干扰物质较少，故无需用净化剂对样品净化。

净化方式对回收率的影响见图1。从图1中可以看出，3种净化方式净化后，除使用50 mg C时，M-290回收率不到70%外，其他净化方式下啶菌噁唑及其降解产物M-257、M-274B和M-290的回收率均在70%～120%之间；但当使用50 mg Florisil时，啶菌噁唑及其降解产物回收率均较好。因此50 mg Florisil被选为本研究中土壤样品的净化剂。

2.4分析方法的线性方程、定量限及基质效应

啶菌噁唑及其降解产物的标准曲线的线性方程、定量限见表3，表4。以最低添加水平确定方法的定量限（LOQ）。啶菌噁唑及其降解产物在土壤中定量限为1.0μg/kg，其标准曲线在0.05～10μg/L范围内线性关系良好，决定系数（R）大于0.99。啶菌噁唑及其降解产物在水中的定量限均为0.1μg/L，其标准曲线在0.1～50μg/L范围内仪器响应与进样质量浓度的线性关系良好，决定系数（R2）大于0.99。

残留农药的定量分析会受基质效应的影响，不同基质对目标化合物的电离产生不同的影响，会降低或增强目标化合物响应[26]。通过基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值（k），可以判断基质效应的大小[27]。当k<0.9为基质减弱效应；k>L1时为基质增强效应；而当k为0.9～L1时为基质效应不明显。在本试验中，除黑土对M-257，水稻土对M-274B，黑土、水稻土、潮土对M-290表现出基质减弱效应外，其他基质对啶菌噁唑及其在土壤中的降解产物的基质效应不明显，可能是样品经过稀释减弱了基质效应。另外，河水和湖水中啶菌噁唑及其降解产物的k值均小于0.9，表现为基质减弱效应。河水对降解产物的基质减弱效应强于湖水，推断河水中总有机碳含量较高抑制了降解产物的离子化效率，导致基质效应减弱。为了弥补基质效应对结果定量分析的影响，保证方法的准确性和通用性，采用基质标准曲线对实际样品进行定量。

2.5分析方法的特异性、准确度和精确度

啶菌噁唑及其降解產物均在3min内出峰，出峰时间如表2所示。从空白色谱图中可以看出，农药及其各降解产物的相应出峰时间内目标化合物没有干扰（图2）。

方法准确度由添加回收率来评估，精确度由不同重复之间回收率的相对标准偏差（ RSD）来评估。啶菌噁唑及其降解产物在5种土壤中的平均回收率为71%～111%，相对标准偏差为0.9%～10.9%（表5），在高有机碳含量和低有机碳含量的水中的平均回收率为80%～111%，相对标准偏差为0.1%～7.5%（表6），均满足《农药登记土壤和水中化学农药分析方法建立和验证指南》（NY/T 3151-2017）[28]残留分析的要求。

2.6实际样品检测

采集了海淀区南长河、玉渊潭公园、圆明园和西城区北海公园4地的地表水，并应用上述方法对此4地的地表水进行检测。结果显示这4地的地表水样品中啶菌噁唑及其降解产物残留值均低于定量限（0.1μg/L）。

3结论

本研究建立的啶菌噁唑及其降解产物在土壤和水中的残留分析方法具有良好的特异性，样品前处理操作简单，方法的线性范围、平均添加回收率及其相对标准偏差等性能指标均满足农药残留分析要求，啶菌噁唑及其降解产物在5种土壤中的平均回收率在71%～111%之间，相对标准偏差为0.9%～10.9%；在高有机碳含量和低有机碳含量的水中的平均回收率在80%～111%之间，相对标准偏差为0.1%～7.5%。啶菌噁唑及其降解产物在土壤中的定量限为1.0μg/kg;在水中的定量限均为0.1μg/L。本方法适用于啶菌噁唑及其降解产物在土壤和水中残留的检测，为啶菌噁唑及其降解产物在环境中残留的安全风险评估提供技术方法和数据支持。