玉米禾谷镰孢茎腐病和穗腐病抗性鉴定接种方法的比较

张海东　董怀玉　王丽娟等

关键词 玉米；禾谷镰孢；茎腐病；穗腐病；抗性鉴定

中图分类号：S 435.131.49 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022196

玉米是我国主要的粮食和饲料作物，也是重要的工业原料和能源植物，自2012年以来，玉米播种面积超越水稻成为我国第一大粮食作物，在国民经济和农业生产中占有重要地位，其生产的稳定性和安全性直接影响我国粮食作物的生产安全和延伸产业的健康发展。近年来随着农业种植业结构调整和耕作栽培方式转变、玉米品种更替以及全球性气候变暖，玉米病虫害发生呈持续加重趋势，已成为制约玉米高产稳产的重要因素。特别是随着全程机械化、秸秆还田、少免耕保护性耕作技术的推广，玉米茎腐病、穗腐病等土传病害已成为各玉米产区重大生产问题，也是治理和防控难点。据估测和统计，全球因病虫害造成的玉米产量损失达19.5%～41.1%，控制玉米病虫害对于保障玉米的安全生产具有十分重要的意义。而种植抗病或耐病品种是防控玉米茎腐病、穗腐病安全、经济和有效的根本措施，筛选优异、稳定的抗性种质是成功选育抗、耐病玉米品种的基础和必要手段[1-3]。育种与生产部门在进行玉米抗性种质鉴定过程中使用的鉴定评价方法各不相同，且抗性评价结果互有差异，寻找快速、准确、简便的鉴定评价方法，是进行种质资源抗病性鉴定的首要问题[4-6]。引起玉米茎腐病、穗腐病的病原菌种类比较多，已报道的病原菌种类均有20余种，国内多数研究认为其致病菌主要为镰刀菌，其中禾谷镰孢Fusarium graminearum为优势致病菌，侵染玉米不仅造成严重的产量损失，且侵染玉米籽粒后产生的真菌毒素可对人畜健康造成严重威胁[7-9]。为此，本文对收集的92份玉米种质分别采用不同的田间人工接种鉴定技术同步开展了玉米禾谷镰孢茎腐病、穗腐病抗性鉴定接种方法比较试验，筛选适宜北方春玉米产区玉米禾谷镰孢茎腐病和穗腐病抗性鉴定的最佳接种方法及抗性种质，以期为促进抗病种质创新、抗病育种及生产上采取有效防病措施提供资源和依据。

1材料与方法

1.1材料

供试的玉米种质共92份，均由辽宁省农业科学院植物保护研究所提供并保存，其中外引种质51份，国内常规种质和自有改良创新种质41份。玉米禾谷镰孢茎腐病对照种质为‘齐319’（抗病）和‘掖107'（感病），穗腐病对照品种为‘X178’（抗病）和‘B73’（感病）。

供试的玉米茎腐病和穗腐病病原禾谷镰孢菌株各1株，均由辽宁省农业科学院植物保护研究所采集辽宁玉米产区田间玉米茎腐病、穗腐病病害样本经单孢分离、纯化培养而获得的纯培养物，经致病力测定筛选的强致病力菌株。

1.2方法

1.2.1接种物制备

1.2.1.1茎腐病接种物繁殖

1）菌土覆盖法和伤根法：将供试玉米茎腐病病原禾谷镰孢菌株接种于灭菌的PDA平板上，于25℃下黑暗培养5～7d，待菌丝布满PDA表面时，转移接种于高压灭菌的玉米粒培养基上（玉米粒浸泡24 h以上，煮th，凉后滤水装入耐高温高压塑料袋中封口于121℃高压灭菌th，冷却备用），于生化培养箱中25℃黑暗培养扩繁，待菌丝布满玉米粒后即可用于接种。

2）茎节注射法：将供试菌株接种于灭菌的PDA平板上，于25℃下黑暗培养5～7d，待菌丝布满PDA表面时，按每10皿培养物兑水700mL的比例，匀浆成糊状，用于注射接种。

1.2.1.2穗腐病接种物繁殖

1）花丝通道法：将供试玉米穗腐病病原禾谷镰孢菌株接种于高压灭菌的SN低营养液体培养基（KHPO 1g，KCl 0.5g，KNO 1g，MgSO*7HO0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，加蒸馏水补足至11）中，于25℃下黑暗振荡培养7～14d，可产生大量大型分生孢子，将培养液经双层灭菌纱布过滤，孢子悬浮液浓度调至2×10个/mL，即可用于接种。

2）双牙签法：将供试菌株接种于PDA平板上，于25℃下黑暗培养扩繁4～5d，备用；选用木质牙签，水煮2～3次，每次煮th，煮后用清水冲洗2～3次，晾至半干后将牙签用硫酸纸包好，高压灭菌30 min，晾凉后平铺于准备好的PDA平板上，将扩繁的病原菌接入铺好牙签的培养基四周，25℃下黑暗培养，使病原菌从培养基向牙签上蔓延生长，经10～14d，当牙签被病原菌覆盖后，即可用于田间玉米接种。

1.2.2接种鉴定方法

病害鉴定圃设于辽宁省农业科学院实验基地内。5月上旬播种，田间顺序排列，每份种质种植10行，行长5m，行距0.6 m，行留苗25株左右。每种人工接种鉴定方法接种2行，2次重复。

1.2.2.1莖腐病接种方法

1）菌土覆盖法：田间接种与播种同步进行，在供试材料播种前3～5 d，将扩繁的玉米粒培养基接种物与过筛潮湿田园土按照1：4比例（质量比）充分混拌制备成浓度为20%的菌土，覆膜保存备用。播种时采用穴播法播种玉米，先播种玉米种子，后将制备的菌土100g／穴覆盖在玉米种子上覆土、镇压。

2）伤根法：在玉米抽雄初期进行，将玉米根系一侧土壤扒开，将病原菌培养物20～30g撒在露出的根系处并覆土。接种后及时进行一次田间浇水，保证病原菌侵染需要的土壤湿度条件。

3）茎节注射法：在玉米植株散粉后3～5 d进行，在植株靠近地表的第2茎节中部，用电钻以45度角斜向下打孔至茎髓部，利用注射器将1.0 mL制备的接种菌液直接注入玉米植株茎髓中，用凡士林封洞。接种后田间浇水1次，此后进行正常肥水管理。

1.2.2.2穗腐病接种方法

1）花丝通道法：在玉米果穗吐丝授粉3～5 d后，利用注射器，从果穗花丝部位将制备好的孢子悬浮液注入果穗，每穗注射接种2 mL。接种后正常肥水管理。

2）双牙签法：在玉米果穗吐丝后14～21 d，花丝已完全萎蔫为接种适期。选择适宜接种果穗，先在果穗中部用大号注射针头穿洞，深度达果穗穗轴中心为宜，防止直接用牙签插入时附着在牙签上的病原菌脱落，然后将带菌牙签2根并排插入果穗接孔中。接种后正常肥水管理。

1.2.3抗性评价方法

田间抗性评价均于9月中旬玉米进入乳熟后期进行。

玉米禾谷镰孢茎腐病茎节注射法调查时，先砍除茎秆上部节段，留地上茎4～5节，用快刀纵剖茎秆，从纵剖面查看茎秆中茎髓部变色的病斑区域大小。逐株调查茎髓部发病面积，记载病情级别（表1），计算平均病情级别并依据其确定供试种质对玉米茎腐病的抗性水平，抗性评价标准见表2[10]。伤根法和菌土覆盖法调查时逐株调查每份鉴定种质的发病状况。剥开近地面玉米叶片，着重调查茎基部节位，茎节或节间变褐色或黑褐色，茎节变软，剖开髓部可见髓部空松，颜色变深，即为发病株。调查记载总株数和发病株数，计算发病株率，以群体发病率确定其对玉米茎腐病的抗性水平，抗性评价标准见表2[11]。

玉米禾谷镰孢穗腐病调查时将接种玉米果穗剥去苞叶，逐个调查记载果穗病情级别：1级：发病面积占果穗总面积0%～1%；3级：发病面积占果穗总面积2%～10%；5级：发病面积占果穗总面积11%～25%；7级：发病面积占果穗总面积26%～50%；9级：发病面积占果穗总面积51%～100%。计算平均病情级别，确定供试种质对玉米穗腐病的抗性水平，抗性评价标准见表2[12-13]。

2结果与分析

2.1茎腐病3种接种鉴定方法的抗性评价结果比较

统计分析玉米禾谷镰孢茎腐病3种接种鉴定方法的抗性评价结果（图1）可知：3种接种方法的发病（发病率或病情级别）严重度依次为茎节注射法>菌土覆盖法>伤根法，鉴定评价表现中抗以上的抗性种质材料分别为20份、56份和67份，占供试玉米种质总数的21.74%、60.87%和72.83%；其中茎节注射法鉴定出的抗性种质以中抗为主，未见表现高抗的材料；而菌土覆盖法和伤根法鉴定出的抗性种质均以高抗为主，中抗次之，表现抗性的材料极少或没有，表明茎节注射法可更好地鉴定出抗茎腐病的玉米种质，其次为菌土覆盖法。

2.2穗腐病2种接种鉴定方法的抗性评价结果比较

从玉米禾谷镰孢穗腐病2种鉴定方法的抗性评价结果（图2）可知，不同接种方法的发病严重度依次为双牙签法>花丝通道法，其中双牙签法鉴定中表现中抗及以上的抗性种质分别为2份（HR）、33份（R）和34份（MR），分别占供试种质的2.17%、35.87%和36.96%；花丝通道法鉴定中表现中抗及以上的抗性种质分别为2份（HR）、56份（R）和27份（MR），分别占供试种质的2.17%、60.87%和29.35%。表明双牙签法能更好地鉴定评价玉米种质对穗腐病的抗病性水平。

2.3抗性玉米种质鉴选

通过不同的接种方法对92份玉米种质进行了2种禾谷镰孢病害的田间抗性鉴定，分别筛选出了一批抗性种质，但不同的接种鉴定方法筛选出的抗性种质有差异。

玉米穗腐病抗性鉴定中‘铁0270’‘W240’‘9539‘CG109’和‘F1803’等66份材料在2种接种方法中均表现出稳定的抗性，占供试玉米种质的71.74%（表3）。

玉米茎腐病3种接种鉴定方法分别鉴选出的抗性种质（表4）中仅有‘铁0203’‘铁0255-1’‘F886’‘9502’‘9556’‘9578’‘LP4-1’‘NET165’‘W382'等9份材料在3种接种方法中均表现出稳定的抗性，只占供试玉米种质的9.78%；而菌土覆盖法和伤根法分别鉴选出的抗性种质中有‘9407’‘W360’‘铁0203’和‘N510’等52份材料在2种鉴定方法中均表现出稳定的抗性，占供试种质的56.52%。

菌土覆盖法和伤根法鉴定筛选出的对茎腐病均表现稳定抗性的52份种质和穗腐病2种接种方法筛选出的表现稳定抗性的66份种质中，有33份种质兼抗禾谷镰孢茎腐病和穗腐病，占供试种质的35.87%（表5）。

3结论与讨论

本研究通过田间人工接种试验对92份玉米种质同步进行了禾谷镰孢茎腐病和穗腐病不同接种鉴定方法的抗性评价与筛选，明确东北春玉米产区玉米禾谷镰孢茎腐病、穗腐病抗性鉴定的最佳接种方法。禾谷镰孢茎腐病3种接种鉴定方法中茎节注射法鉴选出的抗性种质数量最少，原因可能是其人为机械损伤茎部韧皮组织后病菌在茎部髓组织内扩展，仅反映茎部髓組织致病菌扩展的情况，忽略了玉米植株茎秆韧皮组织的物理抗性水平所致[14]；而菌土覆盖法和伤根法更接近田间自然侵染规律，鉴定评价出的抗性种质包含玉米植株茎秆韧皮组织的物理抗性，同时，综合考虑接种鉴定技术的实用性和可操作性，采用菌土覆盖法对大体量种质资源进行田间抗病性鉴定可能更具有优势，而茎节注射法在精准鉴定中可更好地评价玉米种质的抗病性。禾谷镰孢穗腐病2种接种鉴定方法中双牙签法在种质接种后发病的严重度、田间进行接种的可操作性和实用性方面均优于花丝通道法。本研究筛选出一批对2种病害表现抗性稳定的单抗或兼抗种质，这些抗性种质将对我国玉米抗病育种和丰富我国玉米禾谷镰孢茎腐病、穗腐病抗性基因的遗传基础具有重要的利用价值[15-17]。

近年来，我国玉米耕作栽培措施有了很大的变革，密植栽培、秸秆还田、少免耕等保护性耕作栽培技术得到大力推广应用。密植栽培在提高玉米产量的同时，也增加了玉米的抗性负担，而秸秆还田和免耕技术与玉米病害之间的关系十分密切，秸秆覆盖还田后会增加病菌基数，增加病害的发生概率，使玉米病害发生流行呈现多变性，尤其玉米茎腐病，穗腐病等土传病害发生危害逐年加重，且生产上推广的一些玉米品种对茎腐病、穗腐病抗性多在中抗水平及以下；即使是抗性品种，多年连作后也可导致病害的严重发生[18-19]。同时玉米因其植株高大，茎腐病、穗腐病等土传病害多在生育后期呈现发病高峰，田间防控措施难以实施。由此导致以茎腐病、穗腐病为主的土传病害成为当前和未来玉米病害发生的重点及治理、防控难点，必将成为各玉米产区的重大生产问题。田间病害发生情况调查表明，不同玉米品种或种质资源对茎腐病的抗性存在显著差异，抗病品种具有明显降低病害发生率、减轻产量损失的作用。对玉米生育后期的土传病害的治理目前尚无有效单一的防控措施，综合防治以推广种植抗病品种为主，辅以农业防治、化学防治及生物防治等多项措施并举的治理方案[20-22]，其中栽培玉米抗性品种占目前防治方式的43%[23]。优异的抗性种质是进行抗病品种选育的前提和基础，适宜的接种鉴定方法则是挖掘抗性种质的必要手段。今后玉米茎腐病、穗腐病等土传病害研究重点应搜集、挖掘和鉴定玉米种质资源，拓展抗性种质，加大其利用途径，为抗病育种提供新的抗源；避免现有抗性种质资源比较丰富，而育种相对不足的状况；将挖掘到的抗病基因，特别是多抗基因通过生物技术转入到感病优异种质或品种中进行创新改良，为选育抗病品种奠定材料基础[24]；筛选功能菌株研制生防制剂和采取农业综合栽培措施等绿色防控技术。