一株拮抗4种马铃薯病原真菌的拟康宁木霉的分离鉴定

魏琪　郭梅　邵红涛等

关键词 拟康宁木霉；马铃薯；病原真菌；拮抗作用

中图分类号：S 435.32 文献标识码：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022201

木霉Trichoderma spp.是一类在许多生态系统中均有发现的真菌，主要分布于土壤或植物根部[1]。木霉因其高拮抗能力和真菌寄生潜力，对植物病原菌具有广谱的抑制作用，同时，对植物还有促生作用[2]。拟康宁木霉T.koningiopsis分布较广，为全球性分布的种类，在中国于2010被首次报道[3]。目前，我国报道的具备高效抑菌作用的拟康宁木霉菌株尚少，因此发掘不同生境下的菌株用于生物防治研究具有重大意义。

马铃薯Solanum tuberosum是仅次于小麦、水稻和玉米的世界第四大重要粮食作物，在保障粮食安全方面发挥着至关重要的作用[4]。其作为主要粮食、蔬菜和加工原料作物，在我国种植广泛。马铃薯种植过程中常常遭受病害的困扰，尤其是长期连作种植导致病虫害大量聚集和流行，其中以真菌危害（包括晚疫病、早疫病、丝核菌AG3和AG5引起的茎溃疡病、黑痣病、接骨木镰孢引起的块茎干腐病等）为主，不仅限制了马铃薯增产的潜能，同时也增加了马铃薯储藏的损失。

本研究从黑龙江省的土壤中分离获得一株木霉，采用薯块活体抑菌试验和对峙试验测定其对马铃薯4种病原菌的抑制作用，并通过生物学特征和分子生物学鉴定其种类，为其在马铃薯多种病害生物防治中的应用工作奠定基础。

1材料与方法

1.1供试菌株及培养条件

2015年8月8日，于黑龙江省哈尔滨市呼兰区玉米田采集土壤样品，通过选择性培养基分离木霉菌株。供试病原真菌包括融合群分别为AG3和AG5的2株立枯丝核菌Rhizoctonia solani（编号为AG3和AG5）；1株接骨木镰孢Fusarium sambuci-num，1株马铃薯早疫病菌Alternaria solani，上述病原真菌由黑龙江省农业科学院经济作物所病虫害研究室分离保存。

用于分离鉴定的选择性培养基为孟加拉红培养基（蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂粉20 g，1/3000孟加拉红溶液100 mL，蒸馏水900 rnL）；菌株纯化及对峙培养等使用PDA培养基（马铃薯提取物12 g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉14g/L，pH 6.0）。

木霉、丝核菌、镰孢菌的培养温度为25℃，早疫病菌的培养温度为23℃。

1.2菌株的分离纯化

称取10 g土壤样品，加入90 mL无菌水，室温下150r／min振荡培养30 min。吸取上清液采用10倍梯度稀释法分离木霉，每个选择性培养基平板上均匀涂布100μL土壤稀释液。而后，在10稀释液平板上挑取单菌落在PDA培养基上进行纯化，将获得的菌株命名为TC24。

1.3分子生物学方法鉴定木霉TC24的种类

使用天根公司的植物DNA提取试剂盒提取木霉基因组。以木霉TC24的DNA为模板，利用ITS通用引物ITS1／ITS4（ITSl： 5'-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG3′; ITS4： 5′-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3′）[5]进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃预变性5 min; 94℃变性45s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。对PCR产物测序并在NCBI网站（www. ncbi. nlm nih.gov）上进行BLAST比对。应用MEGA X软件与NCBI公布的拟康宁木霉及其他相关菌株的基因序列，利用最大似然法构建系统发育树。

1.4活体测定木霉TC24对病原真菌的抑制作用

采用曲远航等的方法[6]并作改良后，在活体上测定木霉TC24对4种病原真菌的抑制作用。用切块器将马铃薯块茎切成20mm×20mm×10mm的均匀薯块，去离子水浸泡并冲洗掉表面的淀粉，1%NaClO表面灭菌5min，用无菌去离子水冲洗3次。木霉孢子悬浮液浸泡薯块30 min，取出后在超净工作台上晾干。灭菌密封盒内放置无菌滤纸，将晾干的薯块置于滤纸上。每个薯块中心滴加1种病原真菌的孢子悬浮液10μL，每种病原真菌3次重复。以无菌去离子水浸泡的薯块不接种病原菌为水对照；以木霉孢子悬浮液浸泡的薯块不接种病原菌为阴性对照；以无菌去离子水浸泡的薯块滴加病原真菌孢子悬浮液为病原菌对照。将密封盒放置于恒温培养箱中，25℃暗培养7d。采用Excel 2016处理数据，SPSS 22.0软件的t测验分析病原菌对照组与TC24处理组发病级别的差异显著性。

按照以下标准统计发病级别：0级，未见明显病斑；1级，病斑面积≤25%；2级，25%<病斑面积≤50%；3级，50%<病斑面积≤75%；4级，病斑面积>75%。

1.5木霉与病原真菌的对峙培养

根据Halifu等的平皿对峙培养[7]法测定木霉TC24对4株供试病原真菌的抑制作用。用打孔器分别打取木霉和病原真菌的菌饼（直径为6mm）用于对峙培养。处理组：1个木霉菌饼与1个病原真菌菌饼对峙接种于PDA平板（直径为90 mm）上，二者之间的距离为40 mm。对照组：只接种病原真菌。接种菌除早疫病菌在23℃下培养外，其余病原真菌在25℃下培养。拮抗试验重复3次，每次处理组和对照组各接种3个平板。

待对照组病原真菌长满整个培养皿时，分别测量对照平板上靶标菌菌落直径（Φ）和对峙培养平板上靶标菌菌落直径（Φ），计算抑制率并调查覆盖度级别。抑制率的计算公式[5]为：抑制率=（Φ—Φ）/Φ×100%。

以覆盖度表示木霉菌株对靶标菌的寄生能力，覆盖度的分级标准参照陈书华等[8]，设为3级。Ⅰ级：木霉菌落与病原菌菌落不接触，木霉菌丝不能覆盖病原菌菌落；Ⅱ级：木霉菌丝覆盖病原菌菌落1／2以下，病原菌菌落健康，颜色无变化；Ⅲ级：木霉菌丝全部覆盖病原菌菌落，并在病原菌菌落上大量产孢，病原菌菌落萎缩，颜色变暗。

1.6木霉抑制立枯丝核菌的电子显微镜观察

切取木霉TC24和立枯丝核菌交叉位置的菌丝，浸入固定液4%戊二醛中固定4h，缓冲液清洗后，四氧化二锇固定2～4h，双蒸水清洗后乙醇梯度脱水，叔丁醇干燥后离子溅射，用德国蔡司公司SIGMA300热场发射扫描电镜观察记录菌丝形态。

2结果与分析

2.1木霉TC24的形态观察

PDA培养基上，25℃时TC24气生菌丝生长迅速且茂盛，培养72 h菌落可长满9cm培养皿。菌丝初为白色，后有绿色分生孢子产生，菌落无明显的环纹出现（图1a）。分生孢子梗直立，分生孢子梗直接产生瓶梗或产生二级分支，二级分支倾向于对生（图lb）。分生孢子单孢，椭圆形，壁光滑（图lc）。TC24的形态特征与李广记等[3]和罗梅等[9]对拟康宁木霉的形态描述一致。

2.2木霉TC24种的鉴定结果

以TC24的DNA为模板，利用ITS通用引物进行PCR扩增，PCR产物连接至pMD18-T载体后进行测序，获得大小为606bp的片段（GenBank登录号为M2669206）。经过BLAST后，ITS片段與Trichoder-ma koningiopsis菌株Tk1（MT111912.1）的序列相似度达到99%。应用MEGA X软件与NCBI公布的T.koningiopsis菌株的基因序列，利用最大似然法构建系统发育树。结果表明，TC24与T.konzngz-opsis的菌株同为一个分支（图2）。结合形态特征及ITS序列分析结果，菌株TC24为拟康宁木霉T.koningiopsis。

2.3木霉TC24对侵染马铃薯的几种真菌的活体抑制作用

经木霉TC24孢子悬浮液浸泡的薯块接种病原真菌的孢子悬浮液后，与相应的只接种病原真菌的阳性对照薯块相比，发病级别均有所降低（表1）。其中，接种早疫病菌、AG3型立枯丝核菌和AG5型立枯丝核菌时，阳性对照发病级别为1.0～L2级，而TC24处理后的薯块发病为0级（图3a～c，表1）；接骨木镰孢的对照组发病级别为1.8～2.0级，但经过TC24孢子悬浮液处理后发病级别降为0.8～L0级（图3d，表1）。差异显著性分析结果表明：经过木霉TC24处理的块茎上病原菌发病程度极显著低于只接病原菌的对照组（表1）。以上活体试验的结果表明，木霉TC24能够降低4种马铃薯病原真菌病害的发病程度。

同时，经过木霉TC24孢子悬浮液浸泡后的薯块与水对照表现一致（图3e），即木霉TC24可以在马铃薯上安全使用。

2.4对峙培养中拟康宁木霉TC24对病原真菌的抑制作用

通过测量和统计对峙培养中每种病原菌菌落的直径，获得木霉TC24对每种病原真菌的平均抑菌率和平均覆盖度级别（表2）。结果表明，木霉TC24的菌丝生长速度快于致病菌，从而对病菌的生长产生抑制作用，平均抑制率均超过50%。同时，木霉TC24还可以寄生在病菌菌丝上，覆盖度级别分别为Ⅱ级和Ⅲ级，其中，对AG3和AG5两种立枯丝核菌的覆盖度可达100%，同时，可以完全抑制丝核菌产生菌核（图4，图5）。以上结果表明，通过抑制及寄生的方式，木霉TC24可以掏病原真菌菌丝的正常生长。

2.5 TC24对立枯丝核菌抑菌的扫描电镜观察

本研究中以AG3型立枯丝核菌为代表，收集木霉TC24与其对峙培养10 d的样品进行扫描电子显微镜的观察。结果显示：TC24可通过并行（图6a）或缠绕（图6b）的方式寄生于AG3型丝核菌的菌丝上。寄生过程中可完全抑制丝核菌的菌核产生以及菌丝的正常生长。

3结论与讨论

木霉Trichoderma spp.是广泛分布于自然界并具有较高应用价值的土栖真菌，可高效生产木霉胞外酶（如几丁质酶等）[10]。由于它们具有较强的营养和空间竞争能力、寄生作用、分泌抗菌代谢产物、激活植物防御反应及促进植物生长等特点，很多种被广泛用于植物保护，以控制植物病原菌和减少病害发生的严重程度[11]。

本研究从黑龙江省哈尔滨市呼兰区玉米田的土壤内分离获得一株木霉TC24，结合形态学观察和ITS序列比对鉴定为拟康宁木霉T.koningiopsis。通过马铃薯薯块活体抑菌试验和培养基上的对峙培养，发现该菌株对马铃薯多种病原真菌（接骨木镰孢、2种融合群的立枯丝核菌和早疫病菌）具有抑制作用，且对病原菌菌丝生长的抑制率和覆盖度超过50%。TC24对立枯丝核菌的覆盖度可达100%，可完全抑制菌核的产生。

关于拟康宁木霉的生防作用，Moreno等[12]2009年报道其具有生防和诱导植物抗性的作用，可拮抗根串珠霉Thielavoiopsis basicola、拟轮枝镰孢Fusarium verticillioides和尖镰孢F.oxysporum。Ruangwong等[11]研究发现拟康宁木霉菌株PSU3-2可防治辣椒采后由胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides引起的炭疽病。在我国，Chen等[13]从三七Panax notoginseng植株上分离得到一株拟康宁木霉，其对草茎点霉Phoma herbarum、柔毛镰孢Fusarium locci ferum、木栖柱孢霉Scytalidiumlignicola和黑附球菌Epicoccum nigrum有较好的拮抗效果；康彦平等[14]从感染花生的核盘菌Sclero-tinia sclerotiorum菌核上分离到一株拟康宁木霉菌株TM，对核盘菌菌丝生长及菌核的形成有较好的抑制作用；罗梅等[9]从药用植物金丝皇菊Chrysan-themum morifolium‘Huangju’上分离到一株拟康宁木霉菌株Tkl，其对金丝皇菊枯萎病菌（尖镰孢F.oxysporum）和柑橘炭疽病菌（胶孢炭疽菌C.gloeosporioides）具有拮抗作用。本研究分离获得的拟康宁木霉TC24对马铃薯多种病原真菌均具有拮抗作用，可通过竞争生长及寄生作用对病原真菌菌丝生长、菌核形成等造成影响，从而降低发病的严重性。今后，将利用该菌株及其代谢产物进行田间