基于lncRNA DGCR5介导miR-1180/SFRP1/Wnt通路对结直肠癌细胞生长转移的影响*

陈茂良，单汉国

（南华大学附属第二医院 胃肠外科，湖南 衡阳 421001）

结直肠癌（CRC），是全球最常见的消化系统恶性肿瘤之一。近年来，其发病率随着人们生活方式的改变而出现逐年递增的趋势［1］。CRC 是指发生在结肠与直肠任意部位的癌症，但多以直肠与乙状结肠这两个部位常见［2-3］。由于民众体检意识不强、早期临床表现不明显等，目前确诊的CRC 多为中晚期，此时的癌症细胞具有较强的生长、转移、侵袭能力，CRC 远处转移是导致患者死亡的主要原因之一［4-5］。目前CRC 西医治疗以手术切除+辅助化疗为主，具有较好的效果，但化疗为长期治疗，药物毒副作用长期累加致使患者生活质量与治疗依从性明显降低。有研究证明［6-7］经治疗后的患者仍有20%～30%的可能出现癌症复发的情况，且患者5 年内死于远处转移的概率较高。因此，针对CRC 早期的诊断、寻找新的治疗方法或药物一直是临床工作的重点。

目前多项研究证明了SFRP1/Wnt 通路、miR-1180 和lncRNA DGCR5 参与多种肿瘤的病理过程，并且SFRP1/Wnt 通路已被证明与CRC 具有相关性［8］。而miR-1180 与lncRNA DGCR5 在CRC 中虽无相关研究，但是已被证明在其他多种肿瘤细胞中具有重要的作用［9-10］。研究［11］发现lncRNA DGCR5 能够靶向miR-1180，而miR-1180 能够调节SFRP1/Wnt 通路影响肿瘤病理进程。因此，本研究探析lncRNA DGCR5 对CRC 细胞增殖、转移、侵袭的影响，并分析lncRNA DGCR5 是否通过调控miR-1180/SFRP1/Wnt 通路来发挥作用，以为临床诊治CRC 提供思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和转染

选取人结直肠癌细胞系SW480，使用RPMI 1640+10%FBS+1% 双抗培养，于37℃、5%CO2环境下培养。将载体DGCR5 NC、DGCR5 mimic 及DGCR5 inhibitor 和转染试剂如Lipofectamine 2000分别加入Opti-MEM 基础培养基互相混合，静置15 min。静置时间内细胞吸去含血清培养基，PBS清洗一遍，加入基础培养基。将载体和转染试剂的混合液加入细胞，饥饿培养6 h。细胞更换成完全培养基，再培养24 h。根据转染情况将SW480细胞分为对照组（C 组，正常培养SW480 细胞）、DGCR5 NC 组（SW480 细胞+转染DGCR5 NC 载体）、DGCR5 mimic 组（SW480 细胞+转染DGCR5 mimic 载体）以及DGCR5 inhibitor 组（SW480 细胞+转染DGCR5 inhibitor 载体）。

1.2 qPCR 检测DGCR5 表达水平

Trizol 法提取SW480 细胞RNA，RNA 沉淀使用适量的RNase-free 水溶解，通过仪器检测RNA浓度和纯度（OD260/OD280），然后使用甲醛变性胶电泳观察RNA 的降解情况，使用反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA。设计DGCR5 引物，最后按照qPCR 试剂盒说明书，配置反应体系，上机检测。

1.3 细胞增殖

1.3.1 CCK8 取对数生长期的SW480 细胞，消化离心后培养基重悬细胞，细胞计数后调整细胞浓度至5×103/100 μL，96 孔板每孔加入100 μL 细胞悬液，培养24 h 后进行转染操作，每组设3 个复孔，24 h 后每孔加入10 μL CCK8 孵育4 h，摇床低速震荡10 min，酶标仪OD450 nm 检测各孔的吸光值。

1.3.2 克隆形成试验 取对数生长期的SW480 细胞，消化离心后培养基重悬细胞，调整细胞浓度后，分别在培养皿中以50、100、200 个细胞的梯度密度接种，培养3 周左右。当出现肉眼可见的克隆时，使用4% 多聚甲醛固定细胞，吸去固定液，加适量Giemsa 染液染色10～30 min，流水缓慢冲洗。干燥后将平皿倒置，叠加带网格的透明胶片，肉眼直接计数克隆或低倍镜计数大于10 个细胞的克隆数。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.4 细胞凋亡

1.4.1 TUNEL 取对数生长期的SW480 细胞，转染处理。细胞爬片，多聚甲醛固定约1 h，PBS 清洗一遍，加入0.1% Triton X-100 冰浴2 min。PBS清洗两遍，滴加TUNEL 检测液37℃避光孵育1 h。PBS 清洗三遍，最后加抗荧光淬灭剂封片观察。

1.4.2 Western Blot（WB）取对数生长期的SW480 细胞，转染处理后，吸去培养基，预冷的PBS 清洗一遍。加入蛋白裂解液冰上充分裂解细胞，收集细胞裂解液，超声处理，离心取上清。BCA 法进行蛋白质定量，调整蛋白浓度一致，加入SDS 煮蛋白使其变性。取30 左右总蛋白样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿法转膜，5%脱脂牛奶封闭，配置DGCR5、β-catenin 和Wnt 蛋白一抗，4 度孵育过夜。TBST 摇床洗膜3×10 min，使用对应的二抗室温孵育1～1.5 h，TBST 摇床洗膜3×10 min，ECL 曝光，根据目的蛋白/内参蛋白评价蛋白的表达水平。

1.5 细胞迁移

1.5.1 划痕实验 SW480 细胞经过转染处理后，使用枪头在6 孔板底部进行“十”字型划痕。吸去培养基，PBS 冲洗划痕时脱落的细胞，重新加入完全培养基进行培养，每6 小时拍照，根据划痕区域的细胞面积判断迁移能力。

1.5.2 Transwell 侵袭实验 配置BD Matrigel TM基质胶，使用无血清培养基稀释，后将稀释液加入Transwell 小室插件中，使其均匀分布在上室底面。待基质胶凝固后，在上室加入细胞悬液，在下室中加入完全培养基。培养24 h 后取出小室插件，棉签轻轻擦去Transwell 小室内侧面细胞，PBS 清洗两遍。使用4%多聚甲醛固定10 min，再用0.1%结晶紫染色，PBS 液洗去多余结晶紫，自然干燥后小室插件在显微镜下拍照，进入下室的细胞量可以反映细胞穿过基质胶（细胞外基质）的能力，即侵袭能力。

1.6 lncRNA DGCR5 与miR-1180 的靶向关系

1.6.1 预测靶向关系 通过miRanda、Targetscan等生物信息学分析软件预测lncRNA DGCR5 与miR-1180 的靶向关系。

1.6.2 荧光素酶报告基因 设计miR-1180 野生型和突变体引物。提取SW480 细胞RNA，逆转录成cDNA，PCR 扩增miR-1180-wt/mut 片段。胶回收目的基因片段，构建miR-1180-wt/mut 载体。将miR-1180-wt/mut 载体分别与DGCR5 过表达和干扰载体及空载体共转染6 h，更换培养基继续培养48 h 后进行荧光素酶活性检测。

1.6.3 qPCR 取对数生长期的SW480 细胞，经DGCR5 过表达和干扰载体及空载体转染处理后，收集细胞。Trizol 法提取RNA，逆转录成cDNA，设计miR-1180 引物，qPCR 检测miR-1180 的表达，方法同上。

1.7 SFRP1/Wnt 通路检测

1.7.1 WB 取对数生长期的SW480 细胞，转染处理后，提取蛋白。通过WB 检测Wnt、β-catenin和SFRP1 蛋白表达水平，方法同上。

1.7.2 qPCR 取对数生长期的SW480 细胞，转染处理后，收集细胞。Trizol 法提取RNA，逆转录成cDNA，设计miR-1180 引物，qPCR 检测SFRP1的表达，方法同上。

1.8 统计学方法

通过Prism 软件进行数据分析与画图。多组间计量资料以均数±标准差（）表示，用单因素方差分析检验；计数资料以百分率（%）表示，用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SW480 细胞转染后lncRNA DGCR5 的表达（qPCR）

qPCR 检测结果显示，与DGCR5 NC 组比较，DGCR5 inhibitor 组细胞的lncRNA DGCR5 表达水平下降（P＜0.05）；DGCR5 mimic 组细胞的lncRNA DGCR5 表达水平显著高于DGCR5 NC 组与DGCR5 inhibitor 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组SW480 细胞的lncRNA DGCR5 表达水平

2.2 lncRNA DGCR5 对SW480 细胞活力及增殖的影响

2.2.1 CCK8 法检测lncRNA DGCR5 对SW480细胞活力 CCK8 检测结果显示，与DGCR5 NC 组比较，DGCR5 mimic 组细胞相对增值率显著降低；DGCR5 inhibitor 组细胞相对增值率显著高于DGCR5 NC 组与DGCR5 mimic 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 各组SW480 细胞增值能力的比较

2.2.2 克隆形成检测lncRNA DGCR5 对SW480细胞增殖的影响 克隆形成检测结果显示，上调lncRNA DGCR5 后SW480 细胞的克隆数目显著低于C 组与DGCR5 NC 组，下调lncRNA DGCR5 后SW480 细胞的克隆数目显著高于C 组与DGCR5 NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。由此推测lncRNA DGCR5 在体外具有抑制CRC 细胞增殖的能力。见图3。

图3 上调或下调lncRNA DGCR5 对SW480 细胞克隆形成的影响

2.3 lncRNA DGCR5 对SW480 细胞迁移及侵袭的影响

2.3.1 各组SW480 细胞迁移能力比较 划痕实验检测细胞迁移能力结果显示，与C 组、DGCR5 NC组比较，DGCR5 mimic 组细胞愈合率显著降低，DGCR5 inhibitor 组细胞愈合率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 各组SW480 细胞迁移能力对比

2.3.2 Transwell 法检测 lncRNA DGCR5 对SW480 细胞侵袭的影响 Transwell 法检测结果显示，与C 组、DGCR5 NC 组比较，DGCR5 mimic组细胞侵袭数量显著降低，DGCR5 inhibitor 组细胞侵袭数量提高（P＜0.05）。见图5。

图5 各组SW480 细胞侵袭能力比较

3 lncRNA DGCR5 与miR-1180 的靶向关系

荧光酶素报告结果显示，SW480 细胞共转染miR-1180-wt 和DGCR5 mimic 后细胞的相对荧光强度显著低于共转染miR-1180-wt 与DGCR5 NC的细胞组（P＜0.05）；而共转染miR-1180-wt 与DGCR5 inhibitor 的SW480 细胞组相对荧光强度显著高于共转染miR-1180-wt 与DGCR5 NC 的细胞组（P＜0.05）。共转染miR-1180-mut 和DGCR5 NC、共转染miR-1180-mut 和DGCR5 mimic 与共转染miR-1180-mut 与DGCR5 inhibitor 的三组W480细胞组间相对荧光强度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图6。

图6 荧光酶素报告验证lncRNA DGCR5 与miR-1180 的靶向关系

4 lncRNA DGCR5 可介导 miR-1180/SFRP1/Wnt 通路的表达

qPCR 检测结果表明，上调SW480 细胞中lncRNA DGCR5 的表达可使miR-1180、Wnt 表达水平明显降低，SFRP1 表达水平升高（P＜0.05）；下调SW480 细胞中lncRNA DGCR5 的表达可使miR-1180 及Wnt 表达水平明显升高；SFRP1 水平降低（P＜0.05）。进一步WB 检测结果显示，上调lncRNA DGCR5 后Wnt 及β-catenin 蛋白的表达均明显下降，SFRP1 蛋白表达上升（P＜0.05）；下调lncRNA DGCR5 后Wnt 及β-catenin 蛋白的表达均明显上升，SFRP1 蛋白表达下降（P＜0.05）。由此笔者推测lncRNA DGCR5 在CRC 细胞中能够通过调控miR-1180/SFRP1/Wnt 通路的表达，来抑制癌细胞的侵袭与转移。见图7。

图7 lncRNA DGCR5 介导miR-1180/SFRP1/Wnt 通路

5 讨论

有数据调查显示［12］，得益于CRC 诊治、预防技术的发展，近年来早期CRC 患者的生存率有了明显的提高，但晚期CRC 患者由于多数存在癌细胞的转移、扩散，其10 年及以上的生存率仍相当不理想。因而寻找新的CRC 生物标志物与治疗靶点具有重要的临床意义。

lncRNAs 已被证实在癌症细胞的增殖、自噬、转移、侵袭等致病过程中发挥着重要的调节作用［13］。lncRNA DGCR5 是一种肿瘤抑制因子，有研究表明其与肺癌［14］、甲状腺癌［15］、肝癌［16］、膀胱癌［17］等多种癌症细胞的生长、转移有密切的关系。但lncRNA DGCR5 对CRC 细胞增殖、转移的影响目前尚无相关报道。本研究结果显示上调lncRNA DGCR5 的表达后，CRC 细胞的增殖能力降低，下调lncRNA DGCR5 的表达后，CRC 细胞的增殖能力升高（P＜0.05）。而上调lncRNA DGCR5 后，细胞的愈合率及侵袭能力均明显下降，而下调后细胞的愈合率及侵袭能力提高（P＜0.05）。这提示CRC 细胞内lncRNA DGCR5 的表达能够影响癌细胞的生长、转移及侵袭能力。

lncRNA 通常作为内源性RNA 与微小RNA（miRNA）结合，通过降低组织细胞中miRNA 丰度来抑制mRNA 翻译及两者的结合，提高miRNA靶蛋白的表达，从而在癌症细胞的致病过程中发挥调节作用［18-19］。如lncRNA DGCR5 可通过靶向抑制miR-22-3p 来促进肺腺癌的进展［20］；lncRNA DGCR5 还可通过调控miR-21 来促进鼻咽癌细胞的凋亡，抑制其增殖、转移［21］。Wnt/β-catenin 信号转导通路在癌症细胞的生存与增殖中具有重要作用，有研究［22］表明，在90%以上的CRC 中存在着Wnt/β-catenin 通路的异常激活。此外，另有研究证明lncRNA DGCR5 亦可靶向miR-1180 参与调节肺癌的增殖、迁移和侵袭，而miR-1180 已被证明能够调节 SFRP1/Wnt 途径。目前关于lncRNADGCR5 与CRC 的研究尚无报道，因此，笔者猜测lncRNA DGCR5 可能通过靶向miR-1180调控SFRP1/Wnt 通路影响CRC 的病理变化。

本研究通过荧光酶素报告基因实验证明miR-1180 是lncRNA DGCR5 的靶向基因，上调lncRNA DGCR5 的表达能够抑制miR-1180 的表达，而抑制lncRNA DGCR5 后，SW480 细胞中miR-1180 的表达量明显提高。此外本研究还发现，上调lncRNA DGCR5 表达致使miR-1180 表达量下降之后，miR-1180 调节的SFRP1/Wnt 途径的相关基因的表达量亦有所变化，其对应的SFRP1 mRNA与蛋白表达量明显升高，Wnt mRNA 与蛋白表达量和β-catenin 蛋白表达降低。反之下调lncRNA DGCR5 可使miR-1180 的表达量升高，其对应的SFRP1 mRNA 与蛋白表达降低，Wnt mRNA 与蛋白表达量和β-catenin 蛋白表达升高。进一步说明调控lncRNA DGCR5 表达能够有效地抑制CRC 细胞生长，还可通过抑制Wnt/β-catenin 通路来阻断肿瘤细胞的转移。

综上，miR-1180 是DGCR5 的靶基因，抑制或促进DGCR5 的表达能够有效地降低或提高miR-1180 的表达水平。DGCR5 可通过靶向miR-1180调控SFRP1/Wnt 通路来实现对CRC 细胞生长、转移及侵袭的抑制或促进。这提示DGCR5/miR-1180有望成为治疗CRC 的潜在靶点。