micro-CT 观察晚期氧化蛋白产物对兔骨关节炎软骨下骨的影响

余辉 吴庆能 熊光 胡文帅 温辉林 赵进喜 蔡蔚

骨关节炎是一种以软骨退化、滑膜慢性炎症、软骨下骨重塑以及骨赘形成为特点的退行性关节病[1]。研究证实氧化应激是骨关节炎的一种重要致病因素，活性氧自由基 (reactive oxygen species，ROS)在骨关节炎软骨中含量很高[2]。伴随着衰老，软骨细胞内抗氧化酶活性与线粒体功能的显著下降[3]，关节内 ROS 水平逐渐升高，软骨细胞的 DNA 结构受损，端粒长度明显下降，导致软骨基质生成大量减少、软骨细胞老化或出现凋亡[4]。晚期氧化蛋白产物 (advanced oxidation protein products，AOPPs) 是体内重要的氧化应激标记物，已被证实参与了多种疾病的发生与发展[5-8]。同时 AOPPs 又能诱导各种细胞发生呼吸爆发，产生更多的 ROS[9]，造成恶性循环。研究发现原发性骨关节炎和类风湿性关节炎患者血浆中，AOPPs 水平均有显著提高[10]，且 AOPPs能够通过不同途径诱导软骨细胞的凋亡[11-12]，这说明 AOPPs 也是骨关节炎极其重要的致病因子。既往对骨关节炎的研究一直将重点放在关节软骨上，而相关学者却提出软骨下骨的改变要早于软骨的改变[13]。虽然软骨下骨的骨重塑作为骨关节炎启动因素的论断尚缺乏足够的证据，但骨关节炎病程中软骨下骨改变的普遍性已被许多报道证实[14-16]。而研究发现 AOPPs 能诱导成骨样细胞内 ROS 生成、激活 ROS 敏感核转录因子 Kappa B (nuclear factor-κB，NF-κB) 信号，抑制成骨细胞的增殖与分化[17]，还可以通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶依赖的、MAPKs 介导的内源性凋亡通路诱导成骨细胞凋亡[18]。因此，有理由推测，骨关节炎患者关节液中可能存在 AOPPs 蓄积，且 AOPPs 可能是软骨下骨发生骨重塑的一种重要因素。本实验以手术造模[19]的方式制造出兔骨关节炎模型，再由外源性 AOPPs 干预，最终采用高分辨率 micro-CT 来量化并评价软骨下骨的改变。

材料与方法

一、试验设计、时间及地点

本实验为动物对比实验，实验于 2013 年 6 月至2014 年 11 月在南方医科大学南方医院中心实验室完成。

二、实验材料

实验动物：5 月龄雄性新西兰大白兔 24 只，体重 2.0～2.5 kg，由南方医科大学实验动物中心提供。于室温 (22±1) ℃、湿度 50%～60% 的环境下饲养，给予充足的水 (蒸馏水) 和食物 (兔标准化饲料，南方医科大学动物实验中心提供)，严格控制光照周期 (昼 12 h，夜 12 h)。在新环境中适应 10 天后，通过随机数字表法对动物进行区组随机化分组，将动物平均分为晚期氧化蛋白产物组 (AOPPs组)，磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline，PBS)组和假手术组 (Sham组)。本实验方案通过南方医科大学医学伦理委员会审核并批准实施。

三、方法

1.无内毒素 AOPPs 制备方法：将兔血清白蛋白粉末用 PBS 溶解配成 20 mg / ml 溶液后与 40 mmol / L的次氯酸等体积混合后，室温下反应 30 min 后立即转移至透析袋中，放入 PBS 中在磁力搅拌器搅拌下连续透析 24 h，每隔 6 h 更换 PBS 液体，至配制的混合液体中无游离 HCIO。用直径为 0.22 μm 的细菌滤器对配制的液体进行过滤后分装于 50 ml 离心管中备用。为尽可能降低内毒素污染，配液过程中所有玻璃器皿都经高温处理。用除菌滤器过滤配制好的 AOPPs 溶液，使其内毒素水平低于 0.05 ng / mg 水平。使用试剂、仪器详情见表1、2。

表1 使用试剂名称、规格及生产厂家Fig.1 Reagent name, specification and manufacturer

表2 使用仪器、设备名称、型号及生产厂家Fig.2 Instrument, equipment name, model and manufacturer

2.动物造模方法：采用浓度为 30 g / L 的戊巴比妥钠 (1.0 ml / kg) 与速眠新 Ⅱ (0.3 ml / kg) 进行肌内注射麻醉新西兰大白兔后，常规备皮消毒手术区域。其中 AOPPs 组与 PBS 组均行前交叉韧带横断和内侧半月板切除术 (anterior cruciate ligament transection and medial meniscus resection，ACLT +MMx)。Sham 组以同样手术入路暴露关节腔后逐层缝合。

3.动物干预方法：采用膝关节腔内注射干预，将兔固定于兔盒中，屈曲膝关节，用 1 ml 注射器抽取配制好的干预药剂注射入膝关节腔中，隔天注射1 次。

4.处死与取材：使用戊巴比妥钠将兔深度麻醉处死，然后沿大腿外侧中线切开肌肉至小腿远端，充分暴露股骨与胫骨，用咬骨钳将股骨近端与胫骨远端剪断，留取中间含膝关节的部分。将整体的膝关节标本放置在显微手术操作台上，用眼科剪剪开关节囊，分离股骨与胫骨之间的软组织直到将股骨与胫骨分离开。分离开的胫骨经过充分剥离标本上残余软组织后，用生理盐水纱布进行包埋并放入50 ml 离心管中编号置入 -80 ℃ 冰箱储存备用。

5.大体形态观察：用眼科剪将胫骨平台周围软组织剔除干净后对胫骨平台软骨关节面进行观察与拍照。

6.组织学切片番红 O 染色：取各组胫骨，用体积分数 10% 的多聚甲醛溶液固定 24 h 后采用乙二胺四乙酸螯合剂慢速脱钙 8 周，石蜡纵向包埋。将胫骨平台内侧关节面标本纵向分为 4 个区域，取中间2 个区域的软骨及软骨下骨制作 5 μm 厚切片。切片经逐级脱蜡、脱水、用番红染色剂染色 2 min，95%酒精冲去浮色并脱水，擦去标本以外的多余染料，晾干后以中性树脂封片。

7.胫骨软骨下骨的 micro-CT 扫描：将胫骨平台标本垂直置于样品套筒中，以泡沫固定防止标本晃动。然后将套筒固定于 micro-CT 中对标本经行预扫描，在预扫描的基础上选择正式扫描的感兴趣区域后即可开始扫描，扫描参数：电压 45 kV，电流90 μA，扫描分辨率 36 μm，扫描完成后将扫描数据从主机导出。

四、主要观察指标

观察关节软骨损伤程度和软骨基质染色情况。micro-CT 测量参数：骨体积分数 (bone volume fraction，BV / TV)，即骨体积占总骨组织体积的百分比，单位为 %；骨小梁厚度 (trabecular thickness，Tb.Th)，是指骨小梁的平均厚度，单位为 mm；骨小梁分离度 (trabecular separation，Tb.Sp)，是指骨小梁之间的髓腔平均宽度，单位为 mm；骨小梁数目 (trabecular number，Tb.N) 是指在给定长度骨组织与非骨组织的交点数量，单位为 1 / mm；骨小梁结构模型指数 (structure model index，SMI)，定义骨小梁板状和杆状的程度，板状骨小梁和杆状骨小梁的SMI 数值分别为 0 和 3；骨小梁连接密度 (connection density，CD)，是指在给定的空间内骨小梁之间交点的数量，单位为 1 / mm3。

五、统计学处理

采用 SPSS 13.0 软件进行统计学处理。计量数据以±s表示，首先对各组 micro-CT 测量参数行方差齐性检验，各组间比较在方差齐时行 One-way ANOVA，LSD 法多重比较。方差不齐时行 Welch 法，Dunett T3 法多重比较。测量参数之间的相关分析在各组方差齐时应用 Pearson 相关分析，方差不齐时采用 Spearman 相关分析。检验水准 α 值取双侧 0.05。

结 果

一、大体观察结果

Sham 组胫骨平台软骨关节面平整有光泽，关节周围未见骨赘；PBS 组可见关节面软骨出现较小裂纹，关节面局部泛红；AOPPs 组关节面负重区可见明显缺损，关节色泽变暗，周围可见骨赘形成(图1a～c)。

图1 各组的大体标本与组织学切片观察 (番红O 固绿染色 × 200) a：Sham 组胫骨平台软骨关节面平整有光泽，关节周围未见骨赘；b：PBS 组可见关节面软骨出现较小裂纹，关节面局部泛红；c：AOPPs 组关节面负重区可见明显缺损，关节色泽变暗，周围可见骨赘形成；d：Sham 组可见软骨表面光滑平整，基质染色均匀，软骨细胞形态以及分布正常；e：PBS 组软骨表面出现裂隙，基质染色均匀，软骨细胞形态及分布正常；f：AOPPs 组可见软骨出现较大范围损伤，基质染色稍淡，部分软骨浅层部分软骨细胞出现死亡Fig.1 Gross image and histological observation of cartilage of tibial plateau (Alcian blue and Picrosirius red staining × 200) a: In the Sham group, the articular surface of tibial plateau cartilage was smooth and shiny, with no osteophytes around the joints; b: In the PBS group, small cracks in the cartilage and osteophytes were visible around the joints; c: In the AOPPs group, conspicuous defects were observed in the weight-bearing area of the articular surface, accompanied by a darkening of joint coloration and the formation of surrounding osteophytes; d: In Sham group, cartilage surface was smooth and flat with uniform matrix staining, and cartilage morphology and distribution were normal; e: In PBS group, cartilage surface cracks were observed with uniform matrix staining, and cartilage morphology and distribution were normal; f: In AOPPs group, matrix staining was slightly weak, and some chondrocytes appeared in superficial layers of cartilage died

二、组织学切片番红 O 染色结果

Sham 组可见软骨表面光滑平整，基质染色均匀，软骨细胞形态以及分布正常；PBS 组软骨表面出现裂隙，基质染色均匀，软骨细胞形态及分布正常；AOPPs 组可见软骨出现较大范围损伤，基质染色稍淡，部分软骨浅层部分软骨细胞出现死亡(图1d～f)。

三、micro-CT 扫描参数比较

胫骨平台软骨下骨的水平截面、冠状截面 CT表现以及三维重建图见图2。

图2 胫骨平台软骨下骨的水平截面、冠状截面CT 表现以及三维重建图a～c：胫骨平台下软骨下骨水平截面 CT 图，可见 AOPPs 组中 Tb.N 较另外两组减少，骨小梁连接稀疏；d～f：胫骨平台下软骨下骨的冠状截面CT 图，可见在冠状面上AOPPs 组中亦出现了骨小梁稀疏的情况；g～i：胫骨平台下软骨下骨 CT三维重建图，同样可观察到 AOPPs 组中骨小梁数目减少Fig.2 Horizontal plane and coronal plane CT images of subchondral bone of tibial plateau and observation of threedimensional reconstruction of subchondral bone a - c:CT chart of the horizontal section under the tibial plateau, showing that the number of trabecules in the AOPPs group decreased compared with the other two groups, and the trabecular connection was sparse; d - f: Coronal cross section CT of the subchondral bone of the tibial plateau, showing the sparse trabecules in the AOPPs group; g - i: 3D CT reconstruction of the subchondral bone in the tibial plateau, showing reduced trabecular bone in the AOPPs group

BV / TV：Sham 组与 PBS 液组 BV / TV 均较AOPPs 组高，且差异有统计学意义 (P＜ 0.01) 。

Tb.N：Sham组Tb.N 较 AOPPs 组高，差异有统计学意义 (P＜ 0.01)。而 PBS组Tb.N 虽较 AOPPs 组高，但差异无统计学意义 (P＞ 0.05)。

Tb.Sp：Sham 组与 PBS组Tb.Sp 均低于 AOPPs组，且差异均有统计学意义 (前者P＜ 0.01，后者P＜ 0.05) 。

Tb.Th：Sham组Tb.Th 高于 AOPPs 组，差异有统计学意义 (P＜ 0.05)。PBS组Tb.Th 也高于 AOPPs组，但差异无统计意义 (P＞ 0.05)。

CD：Sham组CD 高于 AOPPs 组，差异有统计学意义 (P＜ 0.05)。PBS组CD 也高于 AOPPs 组，但差异无统计意义 (P＞ 0.05)。

SMI：AOPPs 组的 SMI 值更接近 0，其骨小梁形状更偏向于板状，而 Sham 组与 PBS 组的 SMI 值在1.0～1.5，其骨小梁形状并无明显偏向。

四、BV / TV 与 Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp 及 CD 的相关性

骨小梁数目与 BV / TV 之间呈正相关关系 (R2=0.5275，P＜ 0.05)，两者之间存在显著的相关关系；Tb.Th 与 BV / TV 之间呈正相关关系 (R2= 0.2102，P＜ 0.05)，两者之间存在显著的相关关系；Tb.Sp 与BV / TV 之间呈负相关关系 (R2= 0.5491，P＜ 0.05)，两者之间存在显著的相关关系；CD 与 BV / TV 之间呈负相关关系 (R2= 0.4097，P＜ 0.05)，两者之间存在显著的相关关系。

图3 各组之间胫骨平台软骨下骨 micro-CT 扫描参数的比较。*表示与 AOPPs 组相比，差异有统计学意义 (P ＜ 0.05)；**表示与 AOPPs 组相比，差异有统计学意义 (P ＜ 0.01)；SMI 为骨小梁结构模型指数，数值取 0～3 之间，0 表示骨小梁呈板状，3 表示骨小梁呈杆状Fig.3 Comparison of Micro-CT scanning parameters among three groups.*Represented a statistically significant difference compared to AOPPs(P ＜ 0.05); **Indicated a significant difference compared to AOPPs (P ＜ 0.01); SMI was the index of trabecular structure (0 - 3), 0 represented trabecular plate and 3 represented trabecular rod

图4 BV / TV 与骨小梁数目、Tb.Th、Tb.Sp 以及 CD 的相关性分析，R2 为决定系数，决定系数越大，自变量对因变量的解释程度越高，自变量引起的变动占总变动的百分比越高；P ＜ 0.05 表示两者存在显著相关关系Fig.4 The correlation between bone fraction and trabecular number, trabecular thickness, trabecular separation and trabecular connection density separately.R2 was the coefficient of determination, the larger the coefficient of determination, the higher the interpretation degree of the dependent variable, the higher the percentage of the independent variable in the total change; P ＜ 0.05 indicated a significant correlation between the two

讨 论

本研究在实验中观察动物大体标本切片发现：PBS 组大体标本以及软骨切片均可以观察到异于Sham 组的改变，如软骨裂隙和软骨色泽的改变，而在 AOPPs 组中观察到较 PBS 组更为严重的软骨退变，说明外源性 AOPPs 加速了骨关节炎软骨的退变速度。

本研究的主要目的是通过 micro-CT 观察外源性AOPPs 在骨关节炎早期进程中对软骨下骨骨重塑的影响，而描述软骨下骨骨重塑最常用的 micro-CT 指标分别是 BV / TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N、SMI 以及CD。除此之外，笔者还对 micro-CT 扫描的软骨下骨各截面图片以及三维重建图进行了收集与观察，从最直观的角度来说明软骨下骨的改变。实验中发现无论是从水平面还是冠状面观察，AOPPs 组软骨下骨的 Tb.N 明显较另外两组减少，且在三维重建图中观察到了相同的情况。这一现象初步证实了笔者的假设，即外源性 AOPPs 在兔骨关节炎早期病程中对软骨下骨的骨重塑产生了影响。在进一步对各组软骨下骨相关扫描参数的统计学分析中发现，Sham 组与 PBS 组的 BV / TV 较 AOPPs 组高，且差异有统计学意义。同时，Sham 组骨小梁数目较 AOPPs 组高，差异有统计学意义，这一结果说明了外源性 AOPPs加速了骨关节炎早期进程中软骨下骨的骨吸收过程。而软骨下骨骨量以及骨小梁数目的减少又会导致软骨下骨生物力学特性的改变，从而加速软骨的退变。既往研究亦证实 OA 早期关节软骨退变之前，软骨下骨已经出现弹性模量减低、骨量减少的改变[20]。Tb.Sp 是指骨小梁之间的髓腔平均宽度，Sham组与 PBS 组的 Tb.Sp 均较 AOPPs 组高，差异有统计学意义。这说明 Sham 组与 PBS 组的骨小梁排列较AOPPs 组更为致密紧凑，在外源性 AOPPs 干预下，软骨下骨的骨小梁的排列出现了紊乱，出现了类似于骨质疏松的改变。同时 Sham 组的 Tb.Th 较 AOPPs高，且差异有统计学意义，而 PBS组Tb.Th 虽高于AOPPs 组，但差异无统计学意义。这说明在骨关节炎进程中，骨小梁本身的结构发生了改变，即厚度减小。CD 同样是 Sham 组与 PBS 组均高于 AOPPs，但只有 Sham 组与 AOPPs 组之间的差异有统计学意义，说明经 ACLT + MMx 造模的兔骨关节炎早期即出现了软骨下骨骨小梁连接的断裂，即软骨下骨的微损伤。关于 SMI，其主要是在骨质疏松的研究中被用到，本研究发现 Sham 组与 PBS 组的 SMI 值趋于正常，而 AOPPs 组的 SMI 值则接近 0，显示其骨小梁更趋向与板状结构。既往研究发现骨质疏松患者的骨小梁形状更接近于杆状[21]，说明虽然 AOPPs 组的骨量及骨小梁数目减少，出现类似骨质疏松的改变，但其本质上又与骨质疏松却不尽相同。

上述 micro-CT 扫描参数在骨重塑的过程中并不是相互独立的，笔者将其它参数指标与最为主要的指标即 BV / TV 进行了相关分析，以探求哪些指标与 BV / TV 的改变联系最为紧密。最终结果发现Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp 以及 CD 与 BV / TV 都存在显著的相关关系，且除了 Tb.Sp 以外，其余三项指标均与BV / TV 相关性较高。其中 Tb.Sp 与 BV / TV 呈负相关，其余三项指标与 BV / TV 均呈正相关。值得指出的是通过对决定系数R2的分析，发现在骨重塑的过程中，骨小梁数目 (R2= 0.5275)、Tb.Sp (R2= 0.5491)与 CD (R2= 0.4097) 可能是导致 BV / TV 改变的主要因素，Tb.Th 为次要因素。

综上所述，本研究证实了在外源性 AOPPs 的干预下，兔骨关节炎早期病程中关节软骨的退变和软骨下骨的重吸收速度均有显著加快，也从侧面印证了 AOPPs 作为一种内源性致病介质，可能参与了骨关节炎的发生与发展。这一结论为骨关节炎的发病机制提供新方向，从而为临床发展新的疾病干预方式打下理论基础。同时，为研究蛋白质修饰产物在骨关节炎中的致病机制提供新线索和新视角。