不同浓度臭氧化生理盐水对家兔膝关节软骨的影响

朱玉平 孙文阳名 罗金玉 何猛 任微 简乾洪 陆冬玲 王大寿

自 2002 年臭氧引入国内以后，臭氧在疼痛治疗方面的运用越来越广泛。臭氧使用的安全浓度范围、疗效、毒性反应等方面在科研和临床治疗过程中曾有不同程度的分歧。经过多年的动物实验和临床研究，臭氧的运用逐步规范。2021 年 Zhuang 等[1]发表了中国臭氧的专家共识，进一步为规范臭氧的运用奠定了基础。近些年来发现，臭氧溶于水具有比臭氧气体更加安全可靠、有效且浓度可控等优点，于是，臭氧水的研究和应用也逐渐增多。臭氧水的应用依然参考臭氧，但臭氧水的性质毕竟有别于臭氧。目前针对臭氧水的动物实验研究也相对较少，缺乏其不良反应的研究，尤其是膝关节软骨损伤方面。本文拟通过臭氧化生理盐水模拟臭氧水的应用，研究不同浓度臭氧化生理盐水对家兔正常膝关节软骨的影响，以进一步探索臭氧水使用的安全性问题。

材料与方法

一、实验仪器、材料及动物分组

臭氧发生仪 (OZEN2000 型，赫尔曼公司，德国)、剃毛刀、棉签若干、碘酒、生理盐水若干瓶、皮试注射器 (黔天使 1 ml) 若干。新西兰家兔 20 只，购于贵州医科大学动物实验中心 [ 动物许可证编号：SYXK (贵) 2018·0050 ]，体重 (2.61±0.13) kg，均为雄性。采用随机数字表法抽取分组，结合文献报道[1-2]，膝关节臭氧注射浓度一般为 30 μg / ml，也有文献报道 33 μg / ml 的臭氧水浓度作用于膝关节未见不良反应发生，故本研究设置臭氧化生理盐水起始浓度为 30 μg / ml，浓度每组递增 5 μg / ml，以观察是否增加软骨损伤风险和加重损伤的程度。按臭氧化生理盐水浓度的不同分为 4 组，即：Ⅰ组(30 μg / ml)，Ⅱ组 (35 μg / ml)，Ⅲ组(40 μg / ml)，Ⅳ组(45 μg / ml)。

二、臭氧化生理盐水的制备

本实验臭氧化生理盐水的制备参照赵铭等[3]在臭氧化生理盐水对神经病理性疼痛影响研究中的制作方法。即由医用臭氧发生仪制备臭氧，臭氧浓度分别设定为：30 μg / ml、35 μg / ml、40 μg / ml、45 μg / ml，将臭氧分别注入 100 ml 生理盐水中，注入时间为 10 min，注入完毕后封装冰袋低温保存。

三、实验方法

所有的实验动物在安静环境下分笼喂养，保障充足的饲料和饮用水，定期消毒动物房和食物盘，及时清理粪便。实验前运用剃毛刀剔除家兔左膝关节周围腿毛，常规运用碘酒消毒家兔膝关节周围皮肤。臭氧水制备完毕后立即使用皮试注射器分别将相应浓度 (30 μg / ml、35 μg / ml、40 μg / ml、45 μg / ml) 的臭氧化生理盐水注射至家兔左膝关节内，剂量为 1 ml。间隔 7 天后再次以同样的方法向每只家兔同一膝关节腔注射相应浓度的臭氧化生理盐水。第二次臭氧化生理盐水注射后第 7 天进行病理活检取材。

四、取材与标本处理

予以丙泊酚 2 mg / kg 经耳缘静脉诱导麻醉，待家兔丧失意识后同时向耳缘静脉内注射 20 ml 空气处死。常规消毒家兔膝关节周围皮肤，在左膝关节前方纵向切开皮肤、皮下组织，剥离肌肉组织，充分显示股骨下段、膝关节、胫骨上段，分别在膝关节上下 1 cm 处用咬骨钳咬断家兔股骨、胫骨，立即将所标本分别放入甲醛溶液中固定，并在标本盒外做好标记。取材后常规包埋、切片、HE 染色等处理。

五、统计学处理

采用 SPSS 16.0 进行等级资料相关关系分析，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、一般结果

在第二次实验之后，Ⅲ组(40 μg / ml)、Ⅳ 组(45 μg / ml) 各 1 只家兔不明原因死亡，剔除实验组。最终共取材 18 份标本，Ⅰ组5 份，Ⅱ 组5 份，Ⅲ组4 份，Ⅳ组4 份。

二、病理结果

本研究采用日本奥林巴斯显微镜观察家兔软骨病理变化，其结果具体如下：Ⅰ组3 份 (60%) 标本正常，2 份标本出现软骨细胞减少，软骨关节面见局灶性裂隙；Ⅱ 组软骨细胞减少，软骨关节面见局灶性裂隙 1 份，单纯软骨局灶性裂隙 2 份，软骨细胞减少，少数区域软骨基质并粱性减弱 1 份，软骨表面见局灶性裂隙并糜烂 1 份；Ⅲ 组软骨细胞减少，软骨基质并粱性减弱，表面见裂隙及糜烂 1 份，软骨基质并粱性减弱，表面见裂隙及糜烂2 份，软骨细胞减少，软骨表面裂隙及糜烂 1 份；Ⅳ 组软骨细胞减少，软骨基质并粱性减弱，表面见裂隙及糜烂 2 份，软骨细胞减少，软骨表面见裂隙 1 份，软骨基质并粱性减弱，表面见裂隙及糜烂1 份。Ⅱ 组、Ⅲ 组、Ⅳ 组均有不同程度的软骨病理损伤，发生率均为 100%。按照不同病理结果分成 5 类，即：正常、软骨细胞减少、关节面裂隙、软骨面糜烂、软骨基质并梁性减弱，其统计结果见表1，标本典型的病理改变见图1。

表1 不同浓度臭氧化生理盐水所对应病理改变类型Tab.1 Types of pathological changes corresponding to different concentrations of ozonated saline

图1 不同浓度的臭氧化生理盐水导致膝关节软骨的病理改变 (HE 染色×200)a：Ⅰ组(30 μg / ml)：关节软骨正常；b：Ⅰ组 (30 μg / ml)：软骨细胞减少，表面局灶见裂隙；c：Ⅱ组 (35 μg / ml)：软骨细胞数量减少，少数区域基质并梁性减弱，局灶表面见裂隙；d：Ⅲ 组(40μg / ml)：软骨细胞数量减少，基质并梁性减弱，表面见裂隙及糜烂；e：Ⅳ组 (45 μg/ ml)：软骨细胞数量减少，基质并梁性减弱，表面见裂隙及糜烂Fig.1 Different ozonated saline concentrations cause pathological alterations in knee cartilage (HE staining × 200) a: Group Ⅰ (30 μg / ml),the typical articular cartilage; b: Group Ⅰ (30 μg / ml), chondrocyte shrinkage accompanied with surface fissures; c: Group Ⅱ (35 μg / ml), fewer chondrocytes, weaker matrix amalgamation of some sections, and fissures on the focal surface; d: Group Ⅲ (40 μg / ml), fewer chondrocytes,weaker matrix amalgamation, fissures and erosions on the surface; e: Group Ⅳ (45 μg / ml), drastically reduced chondrocyte quantity, weaker matrix amalgamation, fissures and erosions on the surface

三、软骨组织病理分级结果

借鉴骨关节炎研究国际学会 (Osteoarthritis Research Society International，OARSI) 骨关节炎病理评价系统中的软骨组织病理分级标准对本研究关节软骨进行病理分级[4]。0 级：表面软骨灶，软骨形成正常；1 级：表面完整；2 级：表面不连续；3 级：垂直裂隙；4 级：侵蚀；5 级：剥蚀；6 级：畸形。本研究最高病理分级为 3 级，具体结果为：Ⅰ 组0级3例，1级2例；Ⅱ组1级3例，2级1例，3级1例；Ⅲ组3级4例；Ⅳ组2级1例，3 级3例 (表2)。

表2 不同臭氧化生理盐水浓度所导致的软骨组织病理分级Tab.2 Pathological grading of cartilage tissue caused by different ozonated saline concentrations

四、统计学结果

为了解臭氧化生理盐水浓度与家兔膝关节软骨损伤之间是否存在关联，将不同病理分级所对应的臭氧化生理盐水浓度进行等级资料的 Spearman 相关关系分析，定义 X 为臭氧化生理盐水浓度，Y 为软骨损伤的不同病理分级，经 SPSS 计算得出：r=0.515，P= 0.002，结果的差异性有统计学意义 (P＜0.05) 。

讨 论

臭氧又称为三氧 (O3) 或富氧，是一种无色、带有特殊刺激性气味的高性能活性物质，在常规气温、气压下化学性质不稳定，易分解氧气，在水中溶解度较好，是氧气的 10 倍[1,5]。臭氧溶于水后形成臭氧水，常温下克服了臭氧易挥发的特点，具有良好的生物兼容性和安全性[6-8]。本研究的臭氧化生理盐水本质仍然属于臭氧水。臭氧水除了含有 O3，还能产生大量单原子氧 (O-)、羟基 (OH-)、过氧化氢 (H2O2) 等新产物，可迅速分解有机物、细菌及其它微生物[2,9-11]。可见，臭氧水除了兼备臭氧的作用特点外，还兼备 O-、OH-、H2O2等物质的氧化属性，臭氧水的浓度越高，作用效果越高[6,12]。臭氧水具有杀菌、抗炎、止痛、促进组织修复、诱导肿瘤细胞凋亡或坏死等作用，当前臭氧水的研究和应用主要集中于关节注射、口腔和妇科疾病、创面感染、抗肿瘤、消毒等方面[2,9,13-16]。然而，使用过高浓度的 O3可能产生一些不良反应，如：O3对呼吸道有明显的毒性反应 (刺激性咳嗽、呼吸困难、肺水肿等)，O3局部注射可能会产生短暂的疼痛、发热，严重者引起日常生活行为受限、致残，甚至危及生命。皮肤接触臭氧水可能出现脱屑、干燥、灼烧感、色素沉着等，但如今没有一份专家共识或指南提出臭氧水其它应用方式 (如关节注射、局部软组织注射等) 的安全性问题[8-9,17]。高浓度的臭氧水是否存在类似臭氧随浓度升高而不良反应加重的现象，本研究通过观察臭氧水作用于正常家兔软骨后的病理改变进行研究。

本研究结果显示，30 μg / ml 的臭氧化生理化盐水可能造成轻微家兔膝关节软骨损伤。韩文彪等[17]报道臭氧水使用的一般浓度为 10～20 μg / ml。牟建蛟等[13]和王碧颖[14]报道，临床上使用浓度为 23 μg / ml臭氧水注射膝关节，未见明显副作用的发生。而膝关节臭氧注射的安全浓度一般 ≤ 30 μg / ml[1]。本研究使用浓度为 30 μg / ml 的臭氧化生理化盐水高于上述作者[13-14,17]的报道，虽 Ⅰ组(30 μg / ml) 中有 3 份标本病理正常，但出现了 2 份轻度软骨损伤。推测 Ⅰ组(30 μg / ml) 出现病理损伤的可能原因如下[2,5,9,11,18-19]：(1) 由臭氧水本身性质决定，臭氧水半衰期相对于臭氧缩短，臭氧很快在水中被释放、分解，产生更多的强氧化性物质影响软骨细胞 DNA、脂质、蛋白质等物质的代谢，进而引起软骨细胞损伤，臭氧化生理盐水的作用强于臭氧；(2) 臭氧化生理盐水可能改变了关节腔内关节液的酸碱平衡和渗透压，超过关节腔的适应能力造成软骨细胞损伤；(3) Kuśka 等[19]动物实验研究指出，随着臭氧水浓度升高和延长作用时间，臭氧水的破坏力增强。对比周天睿[2]的报道 (臭氧水浓度低于33 μg / ml，作用时间 ＜ 1 h，一般不会产生不良反应)。本实验臭氧化生理盐水虽浓度低于 33 μg / ml，但其作用时间长、频次多 (7 天 1 次，共 2 次)。综合研究和本研究的结果，揭示膝关节臭氧水的注射浓度应 ＜ 30 μg / ml。但肖旭洋等[20]曾报道，20 μg / ml 的臭氧水也能引起家兔膝关节骨关节炎的关节软骨基质变性，明显低于本研究的臭氧水研究起始浓度 (30 μg / ml)，其原因可能是作者的研究标本为膝骨关节炎模型，膝骨关节炎模型在实验前已存在软骨的损伤，与本研究标本不一致。Kuroda等[9]进行臭氧水抗肿瘤的实验中发现，臭氧水不会引起正常组织的不良反应，结论与本研究矛盾。

樊荣等[21]发现，低浓度臭氧 (20 μg / ml、40 μg / ml) 作用于正常软骨细胞后出现少量的核固缩，高浓度臭氧 (60 μg / ml) 注射后出现软骨细胞肿胀、空泡样变及核固缩明显等。暗示臭氧超过一定浓度会造成软骨损伤，且随着浓度增加可能加重损害程度。本研究臭氧化生理盐水与膝关节软骨病理损伤的 Spearman 相关关系提示，膝关节软骨损伤程度与臭氧化生理盐水的浓度密切相关，且随着臭氧化生理盐水的浓度增加，膝关节软骨病理损伤程度相应加重 (P＜ 0.05)，与作者报道的臭氧作用结果类似。Küçük 等[6]在不同浓度臭氧水对牙髓细胞毒性的研究中得出，对比较高浓度 (8 mg / L，16 mg / L)臭氧水，较低浓度 (2 mg / L，4 mg / L) 的臭氧水更易促进牙髓细胞增殖。说明臭氧水的作用属性 (浓度越高，作用越强，产生的不良反应也越严重) 与臭氧基本相似[2,5]。

综上所述，臭氧化生理盐水浓度 ≥ 30 μg / ml可能对正常家兔膝关节软骨造成损伤，且随着臭氧化生理盐水浓度的递增，引起膝关节损伤的程度也会增加。鉴于经费和本研究样本量的限制，结论有待大样本、更多实验进一步证实。