不同产地老鹳草指纹图谱的建立及抗肿瘤谱效关系研究

孙仁爽，赵敏婧

不同产地老鹳草指纹图谱的建立及抗肿瘤谱效关系研究

孙仁爽1，赵敏婧2

1. 通化师范学院医药学院（长白山天然药物重点实验室），吉林 通化 134001 2. 梅河口市食品药品检验检测中心，吉林 梅河口 135000

建立老鹳草指纹图谱，研究老鹳草提取物的指纹图谱与抗肿瘤活性之间的谱效关系，初步明确老鹳草抗肿瘤主要活性成分。运用中药色谱指纹图谱相似度评价软件，建立老鹳草抗肿瘤活性部位的HPLC指纹图谱。采用MTT法，以人乳腺癌MCF-7细胞为模型，对老鹳草样品的醋酸乙酯部位进行抗肿瘤活性测定。采用多元线性回归法，将量化共有峰面积与MTT法测得老鹳草抗肿瘤活性结果相结合，构建老鹳草抗肿瘤谱效关系。通过指纹图谱的建立，共标定了16个共有峰，确定1号峰为没食子酸、7号峰为柯里拉京、8号峰为老鹳草素、12号峰为鞣花酸。其中29批药材的相似度均大于0.732，运用主成分分析和聚类分析进一步分析样品间差异，将距离较远的30号样品排除。HPLC指纹图谱中的16个共有峰中，有8个峰对MCF-7细胞有作用，得到MCF-7的谱效方程，经6批药材验证，谱效方程计算值与实际值的偏差率不超过10%。该谱-效方程可用于预测老鹳草的抗乳腺癌作用物质基础。

老鹳草；指纹图谱；抗肿瘤；谱效关系；没食子酸；柯里拉京；老鹳草素；鞣花酸

老鹳草为牻牛儿苗科植物老鹳草Maxim的干燥地上部分[1]，具有祛风湿、通经络、止泻痢等作用[2-3]。目前对老鹳草的研究多停留在化学成分的含量测定及指纹图谱，这些研究[4-6]所获得的HPLC图谱不能反映出老鹳草的内在药效。老鹳草有明显的抗肿瘤作用，常用于乳腺癌、结肠癌和肺癌等肿瘤的治疗。老鹳草中含有多种生物活性成分，可以抑制癌细胞的生长和分裂，同时通过促进免疫功能，抵御癌症的侵袭，因此，老鹳草常被用于癌症的辅助治疗。本实验根据老鹳草的功效，选择其抗肿瘤作用作为药效指标，对老鹳草有效部位的指纹图谱和抗肿瘤作用的关系进行初步的探讨，建立能反映老鹳草抗肿瘤药效[7-9]的谱效关系方程，阐明其抗肿瘤作用的物质基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

药材经通化师范学院医药学院于俊林教授鉴定为牻牛儿苗科老鹳草Maxim.的干燥地上部分，其来源信息见表1。

表1 30批老鹳草药材产地信息

1.2 试剂

对照品老鹳草素（批号100503，上海融禾医药科技有限公司）、没食子酸（批号110831-201906）、柯里拉京（批号111623-200302）、鞣花酸（批号111959-201903）、羟基喜树碱（批号110832-201908）购自中国食品药品检定研究院，质量分数均≥98%。人乳腺癌细胞株MCF-7由首都医科大学中药学院传代保种。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；甲醇和乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

WELLSCAN MK 3型酶标仪（美国Bio-Rad公司），Agilent1260高效液相色谱仪，KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），CP225D型电子天平（德国Sartorius公司）。

2 方法

2.1 老鹳草HPLC指纹图谱的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸对照品，置于4个50 mL量瓶中，分别用甲醇定容。制成分别含没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸232、120、50、150 μg/mL的单一对照品溶液。再精密量取没食子酸、柯里拉京、老鹳草素和鞣花酸对照品溶液各1 mL置10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成含没食子酸23.2 μg/mL、柯里拉京12 μg/mL、老鹳草素5 μg/mL和鞣花酸15 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 称取老鹳草约1 g，精密称定，粉碎，用18 mL 70%丙酮超声提取60 min，滤过，滤液减压浓缩得浸膏，减压回收温度均不超过40 ℃，浓缩液置10 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，得供试品溶液，备用。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相见表2，体积流量为0.8 mL/min，检测波长278 nm，进样体积2 μL。

2.1.4 精密度试验 取老鹳草样品（S1）适量，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，得到各图谱的相似度均大于0.92，计算16个主要共有峰相对保留时间RSD＜2%，峰面积RSD＜2%，符合指纹图谱的要求。

表2 流动相的梯度洗脱程序

2.1.5 稳定性试验 取老鹳草样品（S1）适量，按照“2.1.2”项方法制得供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h，按“2.1.3”项色谱条件进行测定，将所得数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，得到各图谱的相似度均大于0.93，计算16个主要共有峰相对保留时间RSD＜2%，峰面积RSD＜2%，符合指纹图谱的要求。

2.1.6 重复性试验 取老鹳草样品（S1）适量，按照“2.1.2”项下方法平行制得6份供试品溶液，按“2.1.3”项色谱条件进行测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，得到各图谱的相似度均大于0.91，计算16个主要共有峰相对保留时间RSD＜2%，峰面积RSD＜2%，符合指纹图谱的要求。

2.1.7 老鹳草化学指纹图谱的构建 精密吸取供试品溶液，分别注入液相色谱仪，按照“2.1.3”项色谱条件检测。采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”进行模式识别，获得了老鹳草指纹图谱的共有模式[10]。以中国食品药品检定研究院提供的老鹳草对照药材为参照图谱，对照图谱的生成方法为平均数法。

2.2 抗肿瘤活性的测定

2.2.1 样品溶液制备 用蒸馏水悬浮分散浸膏后，依次用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取。分别称取各样品适量，用80 μL DMSO配成25 g/L的母液，再用RPMI-1640培养液分别稀释成0.5、5、50、100、250、500 mg/L溶液，备用。阳性药羟基喜树碱用RPMI-1640培养液稀释成0.01、0.1、l、10、100 mg/L溶液。

2.2.2 细胞培养 MCF-7细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2.3 MTT法测定各样品的抗肿瘤活性 将对数生长期的细胞用胰酶消化后配制成浓度为1×104个/mL的细胞悬液，按1000个/孔接种于96孔板，每孔加100 μL。次日加入含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100 μL（DMSO终浓度＜0.5%），每药设4个剂量组，每组设6个平行孔，给药后于37 ℃继续培养72 h后，弃上清，每孔加100 μL新鲜配制的含0.5 mg/mL MTT的无血清培养基，继续培养4 h，弃上清液，每孔加200 μL DMSO溶解MTT甲沉淀，用微型振荡器振荡混匀，用酶标仪在参考波长490 nm，检测波长570 nm条件下测定吸光度（）值，以溶剂对照处理的肿瘤细胞为对照组，用公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率。并按中效方程计算半数抑制浓度（IC50）。

抑制率＝(对照组平均值－给药组平均值)/对照组平均值

2.3 老鹳草抗肿瘤谱-效关系研究

2.3.1 建立老鹳草抗肿瘤谱-效关系方程 将HPLC法测定所得各峰面积均数化[11]，处理成量化共有峰数据。处理后的共有峰数据（）为各峰与各峰平均面积的比值（＝峰的面积值/峰平均面积值），以衡量样品中各成分含量的变化情况。以量化共有峰数据为自变量，肿瘤细胞增殖抑制率为因变量，使用软件SPSS 21.0，采用后退法建立谱效关系[12]方程。

2.3.2 建立老鹳草抗肿瘤谱-效关系验证方程 为证明所列方程的合理性，将HPLC法测定各峰数据均数化峰面积，处理成量化共有峰数据，代入方程进行验证[13]。

3 结果与分析

3.1 老鹳草HPLC指纹图谱分析

3.1.1 相似度评价 将30个老鹳草样品的AIA格式的数据文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2004A）》软件，以吉林通化药材（S1）作为参照谱图，多点校正生成对照图谱（R），计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱的相似度，相似度在0.589～0.976，大部分样品相似度较高，但是由于产地、生长环境和提取纯化过程等原因，个别样品与对照图谱差异较大，不能直接建立老鹳草药材指纹图谱[14]的共有模式。运用主成分分析和聚类分析进一步分析样品间差异，以便最终能够建立合理的老鹳草药材的标准指纹图谱。

3.1.2 主成分分析（principal components analysis，PCA） 各老鹳草样本经过上述实验获得各自的色谱数据，通过色谱工作站将图谱进行积分后以保留时间和色谱峰面积作为数据的信息，以相对保留时间定位，以对应的峰面积的积分值作为数据源，形成30个样本数据矩阵。对数据矩阵进行PCA投影。老鹳草数据PCA的平面投影图见图1，结合旋转成份矩阵列表可知，30号样品和前3种成分的相关度都很低，属于第4种成分。可见30号样品与其他样品差距较大，进一步缩小了选择范围。

图1 PCA平面投影图

3.1.3 系统聚类分析 对30个样品数据进行系统聚类分析，采用组内联结法、夹角余弦作为测量的距离变量，聚类树形图见图2，结合PCA分析结果，将距离较远的30号样品排除。

3.1.4 老鹳草药材标准指纹图谱的建立 将上述29批样品的AIA数据文件导入软件，对上述药材进行相似度评价，设定S1为参照，多点校正，设定参照图谱，将谱峰自动匹配，生成的叠加图见图3，得到的共有峰对照图谱见图4，结果29批老鹳草药材具有16个共有峰。相似度计算结果见表3。相似度计算结果表明，29批样品与对照图谱比较，相似度均在0.732以上，说明不同来源老鹳草样品化学成分差异较大，可为老鹳草药材的品质评价提供科学依据。

图2 老鹳草样品聚类分析

图3 29批老鹳草药材提取物的HPLC叠加图

1-没食子酸 7-柯里拉京 8-老鹳草素 12-鞣花酸

表3 29批样品相似度评价结果

3.1.5 老鹳草主要共有峰归属 经过相似度软件分析出29个产地老鹳草药材具有16个共有峰。保留时间依次为12.155、17.893、20.575、27.067、36.649、39.43、50.182、52.617、57.233、59.529、81.643、82.789、84.856、88.980、90.273、91.759 min。将各峰依次编号为1～16。通过对照品色谱图指认，确定1号峰为没食子酸，7号峰为柯里拉京，8号峰为老鹳草素，12号峰为鞣花酸。

3.2 抗肿瘤活性分析

3.2.1 老鹳草中各萃取部位的抗肿瘤活性 实验结果显示老鹳草的醋酸乙酯和正丁醇部位对肿瘤细胞都有一定的抑制作用，其中醋酸乙酯部位对MCF-7细胞的IC50为（12.47±3.86）μg/mL（表4），小于30 μg/mL。一般认为当植物粗提取物IC50≤30 μg/mL时，可初步认为有一定的抗肿瘤作用，值得进一步研究[15]。因此老鹳草70%丙酮提取物的醋酸乙酯部位活性相对最强，确定为老鹳草的抗肿瘤活性部位。

表4 老鹳草不同萃取部位对MCF-7细胞的IC50(, n = 3)

3.2.2 老鹳草醋酸乙酯部位抗肿瘤活性测定 29份老鹳草药材的醋酸乙酯部位对肿瘤细胞MCF-7的抑制率见表5。

3.3 老鹳草抗肿瘤谱-效关系研究

3.3.1 量化共有峰数据 随机选取23个样品的量化共有峰数据结果见表6，将16个共有峰依次设为1、2、3……16。剩余6个样品用于验证的量化共有峰数据见表7。

表5 老鹳草提取物对MCF-7细胞的抑制率

表6 23个老鹳草样品醋酸乙酯层的HPLC量化共有峰均数化数据

续表6

表7 6个验证样品的HPLC量化共有峰均数化数据

3.3.2 老鹳草抗乳腺癌谱-效方程 用后退法筛选出来的对抑制MCF-7细胞株生长有显著贡献的变量有8个，即1、2、5、10、12、13、14、15。老鹳草抗乳腺癌谱-效方程为＝0.234＋0.0471＋0.0522＋0.1025－0.03310＋0.09712－0.11213－0.08614＋0.15715

3.3.3 残差图 方程残差服从近似正态分布，自变量和因变量之间呈线性关系，说明所用模型适合用于建立老鹳草醋酸乙酯提取物的抗乳腺癌谱-效关系方程，见图5、6。

图5 因变量马氏距离分布直方图

图6 因变量正态概率图

3.3.4 验证方程 将6个验证样品的量化共有峰数据代入老鹳草抗乳腺癌谱-效方程，计算偏差率。

偏差率＝估计值/真实值－1

从表8可以看出，由所建立的数学模型计算得到的6批老鹳草验证样品的抑制率估计值与实验测得真实值的偏差率全部在±10%以内。

4 讨论

4.1 最佳提取工艺的考察

本实验选用70%丙酮为溶剂对老鹳草中的成分进行提取。通过干酪素法对总鞣质含量进行测定，确定老鹳草的最佳提取工艺。选取料液比（A）、超声时间（B）和超声频率（C）为主要考察因素，每个因素取3水平，正交试验表安排试验方案，分析结果表明，以总鞣质为考察指标时，各因素的影响大小均为A＞C＞B，即料液比影响最大，超声时间影响最小。根据正交试验确定的最佳提取条件为：液料比为1∶18的70%丙酮在100 kHz超声频率下超声提取60 min。验证实验，重复3次，得到总鞣质质量分数为1.83%。结果表明确定的最佳提取工艺效率较高，切合实际。

表8 老鹳草抗乳腺癌谱-效相关质量评价数学模型验证结果

4.2 色谱条件的考察

本实验以采于黑龙江大庆的9号老鹳草样本考察了Agilent XDB-C18色谱柱、Agilent Zorbax-C18色谱柱、Agilent Extend-C18色谱柱、迪马C18色谱柱、大连依利特C18色谱柱和美国热电C18等6种色谱柱的分离情况，色谱柱规格均为（250 mm×4.6 mm，5 μm），结果发现各色谱柱基本都能达到基线分离，但是各色谱柱峰位顺序改变，因此选用其中一种分离情况最好、出峰最多的Agilent公司的XDB-C18作为实验用色谱柱。本实验分别用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-0.3%磷酸盐为流动相，以不同梯度进行试验，结果表明用甲醇-乙腈-0.3%磷酸盐梯度洗脱效果最好；体积流量考察了0.8、1.0和1.2 mL/min，结果1.0、1.2 mL/min的体积流量分离效果不好，选用0.8 mL/min作为流动相的体积流量。

4.3 谱效关系

实验在不同批次老鹳草提取物HPLC指纹图谱共有峰与其抗肿瘤作用数据量化的基础上，采用后退法对老鹳草指纹图谱共有峰与抗肿瘤作用的大小进行相关性研究。结果显示，采用体外活性筛选确定了老鹳草醋酸乙酯萃取部分对MCF-7细胞的生长抑制率最强，作为本实验老鹳草抗肿瘤的活性部位。以29个老鹳草样品为研究对象，开展高效液相色谱分析，所构建的老鹳草化学指纹图谱，共有16个共有峰，分析指纹图谱，可见各样品的共有峰面积有差别。由所建立的数学模型计算得到的6批老鹳草验证样品的抑制率估计值与实验测得真实值的偏差率均在±10%以内。本实验建立了老鹳草抗乳腺癌谱效关系方程，体现了中药药效的产生是多成分相互协调、互补或制约的结果，为老鹳草药材质量控制提供参考[16]。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Establishment of fingerprints and spectrum-effect relationship of anti-tumor activity offrom different places of origin

SUN Ren-shuang1, ZHAO Min-jing2

1. Changbai Mountain Key Laboratory for natural medicine, Medical College, Tonghua Normal Univetsity, Tonghua 134001, China 2. Meihekou Food and Drug Control, Meihekou 135000, China

To establish the HPLC fingerprint ofstudy the spectrum-effect relationship of anti-tumor activity ofand preliminarily clarify its main anti-tumor active components .The similarity evaluation software of traditional Chinese medicine chromatographic fingerprints was used to establish the HPLC fingerprints of the anti-tumor active fractions ofMTT method was used to determine the anti-tumor activity of effective parts ofby using human breast cancer cell MCF-7 as a model. Multiple linear regression method was used to combine the quantitative characteristic peak area with the anti-tumor activity results ofmeasured by MTT method to construct the anti-tumor spectrum effect relationship ofThrough the establishment of fingerprint, 16 common peaks were picked, it is determined that peak 1 is gallic acid, peak 7 is corrilagin, peak 8 is geranium, and peak 12 is ellagic acid. The similarity of each sample was higher than 0.732. Further analyze the differences between samples using principal component analysis and cluster analysis, and exclude sample 30 that is farther away.The results showed that 8 of the 16 common peaks in the HPLC fingerprint had effects on MCF-7 cells, and the spectral efficiency equation for MCF-7 was obtained. After verification by six batches of medicinal materials, the deviation rate between the calculated value of the spectral efficiency equation and the actual value was not exceed 10%.The spectrum-effect equation can be used to predict the anti-breast cancer effect of.

Maxim.; fingerprint ; anti-tumor; spectrum-effect relationship; gallic acid; corilagin; geraniin; ellagic acid

R286.2

A

0253 - 2670(2023)15 - 5003 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.025

2022-12-06

国家自然科学基金项目（81973431）；通化师范学院应用研究项目：中药质量评价研究（01054）

孙仁爽，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为中药药效物质基础和质量控制研究。E-mail: 804590217@qq.com

[责任编辑 时圣明]