基于网络药理学和实验验证探讨甘草防治非酒精性脂肪肝病及肥胖的作用机制

李 云，刘天宇，袁恒杰，李正翔

基于网络药理学和实验验证探讨甘草防治非酒精性脂肪肝病及肥胖的作用机制

李 云1，刘天宇2，袁恒杰1，李正翔1*

1. 天津医科大学总医院 药剂科，天津 300052 2. 天津医科大学总医院 消化科，天津 300052

基于网络药理学和实验验证探讨甘草et防治非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）及肥胖的活性成分、作用靶点及潜在机制。采用TCMSP数据库结合已发表文献筛选获得甘草主要活性化学成分及其作用靶点，GeneCards数据库获取NAFLD及肥胖靶点，分别用String平台、Cytoscape 3.9.1软件分析并构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。借助Metascape平台分析交集靶点并进行基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，采用Cytoscape 3.9.1软件构建“甘草成分-疾病靶点-通路”网络，进一步采用分子对接验证预测的关键成分与靶点之间的结合能力与亲和力，通过动物实验证实关键成分对靶点通路的调控作用。甘草主要通过核心活性成分槲皮素、甘草酸、山柰酚、柚皮素和芒柄花素等作用于前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、过氧化物酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）及糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B）等关键靶点蛋白，经脂质与动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信号通路、PPAR信号通路、T细胞受体信号等通路发挥防治NAFLD及肥胖的功效。活性成分甘草酸可以缓解高脂饮食小鼠肝脏脂肪变性，显著减轻小鼠体质量增加（＜0.05），明显改善血脂及肝功能水平（＜0.05、0.01），同时显著增加肝脏视黄酸受体α（retinoic acid receptor RXR-alpha，）、及胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，）的mRNA及蛋白表达（＜0.05、0.01）。甘草通过多成分、多靶点、多途径干预NAFLD及肥胖，其主要活性成分甘草酸能通过激活高脂饮食小鼠肝脏RXRA/PPARG/ CYP7A1信号通路发挥抗NAFLD及肥胖药效作用。

网络药理学；甘草；非酒精性脂肪肝病；肥胖；高脂饮食小鼠；甘草酸；柚皮素；芒柄花素；RXRA/PPARG/CYP7A1信号通路

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）及肥胖在全世界的发病率迅速增加，二者已成为慢性炎症性疾病及代谢性疾病病死率的重要危险因素，并成为新的全球卫生问题之一[1-2]。NAFLD及肥胖均由遗传背景和环境因素共同作用引起，发病隐匿。NAFLD病理改变包括肝脏单纯脂肪变性、脂肪性肝炎、肝硬化甚至可发展为肝细胞性肝癌，肥胖往往由高脂高糖饮食引起，以脂肪过度堆积为特征，脂肪沉积在肝脏则表现为脂肪肝。NAFLD的病理生理学机制复杂，目前并未完全阐明，临床尚无专一对症药物治疗，常以抗炎、降酶、保肝药物等辅助改善症状[3]；肥胖临床治疗药物种类有限，选择性少，且多见胃肠道及营养素缺乏等不良反应[4]。与此同时，多项临床回顾研究指出NAFLD的全球患病率约25%[5]，而在当今肥胖流行的情况下则持续上升，约36.1%[6]，二者关系密切，同时具备两者特征的群体背后常具有相同的诱因和发病机制[7]。临床目前针对NAFLD及肥胖的主流治疗方式仍为生活方式饮食干预、控制体质量及血糖。因此，针对诱因及病机相同的NAFLD和肥胖患病人群寻找可用于改善二者的中药及中药活性成分并加以合理研究利用具有重要社会价值。

甘草为豆科植物甘草Fisch.、胀果甘草Bat.或光果甘草L.的干燥根及根茎，味甘，性平。甘草最早收载于《神农本草经》，并列为上品，明代李时珍《本草纲目》中更将其列为百药之首。临床上具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药等功效，因而也是我国最常用的大宗药材之一，在民间素有“国老”之称。甘草中主要有效成分为甘草酸皂苷类和黄酮类化合物[8]。现代临床和药理研究表明，甘草粗提物具有减轻体质量、抵抗NAFLD、改善糖脂代谢等多种作用[9-12]，临床上也将各类甘草酸制剂应用于NAFLD的治疗，并取得较好的疗效[13-14]，近来研究发现甘草酸制剂可减轻高脂饮食诱导的小鼠肥胖[15]。然而代谢性疾病临床病理变化复杂，且甘草的药效物质基础及其作用机制尚不明确。因此，系统整体地研究甘草抗NAFLD及肥胖生物活性成分及其潜在分子作用机制，可为临床用药的选择和创新提供参考依据。

网络药理学是从整个生物网络角度去探究疾病机制和药物作用机制的新兴学科，在整合了医学、生物学、计算机科学、生物信息学等多学科基础理论的基础上，可系统预测中药有效活性成分及药物作用机制。本研究运用网络药理学的研究思路和方法，结合分子对接验证与动物实验药效评价，探讨了甘草抗NAFLD及肥胖的主要活性成分及作用靶点，揭示其潜在的作用机制，对阐释甘草抗NAFLD及肥胖的科学内涵、推广其临床应用、挖掘临床防治NAFLD及肥胖的中药活性成分具有重要意义。

1 材料

1.1 动物

SPF级4周龄C57BL/6J雄性小鼠15只，体质量（20±2）g，购自北京华阜康生物科技有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0008，饲养于天津医科大学SPF级实验动物中心。动物实验经天津医科大学总医院实验动物福利伦理委员会批准（批准号IRB2022-DWFL-353）。

1.2 药品与试剂

甘草酸（批号200116，质量分数＞98%）由江苏正大天晴药业股份有限公司提供；鼠源过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，）引物（F: 5’-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3’，R: 5’-GTAAT- CAGCAACCATTGGGTCA-3’）、胆固醇7α-羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，）引物（F: 5’-AGGCATTTGGACACAGAAG-3’，R: 5’-ACAGAT- TGGAGGTTTTGCAT-3’）、视黄酸受体α（retinoic acid receptor RXR-alpha，）引物（F: 5’-ATGGACACCAAACATTTCCTGC-3’，R: 5’-CCAG- TGGAGAGCCGATTCC-3’）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，）引物（F: 5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，R: 5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’）购自苏州金唯智生物技术有限公司；Trizol试剂（批号017E2231FA）、逆转录试剂盒（批号7E691I2）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PPARG兔单克隆抗体（批号GR240085-9）、CYP7A1兔多克隆抗体（批号GR240038-2）、RXRA兔单克隆抗体（批号GR152085-14）、HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（批号15044790-5）购自英国Abcam公司；β-actin兔单克隆抗体（批号F210094）购自上海泊湾生物科技有限公司；RIPA裂解液（批号20220416）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号20230206）购自北京索莱宝科技有限公司；

1.3 仪器

D37520型低温高速离心机（德国Kendro公司）；7180型全自动生化分析仪（日本Hitachi公司）；组织脱水机、石蜡包埋切片机（德国Leica公司）；SZX7型光学显微镜（日本Olympus公司）；DNA Thermal Cycle 480扩增仪（美国Perkin Elmer Cetus公司）；Realtime PCR仪、5415D型小型台式高速离心机（上海锐聪实验室设备有限公司）；Infinite M200 Pro型多功能酶标仪（奥地利Infinite公司）；电泳仪和转膜仪（美国Bio-Rad公司）ChemiScope 6200型化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 网络药理学分析

2.1.1 甘草潜在活性成分及靶点的获取、NAFLD及肥胖相关靶点的获取 利用TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索“甘草”活性成分及靶点，将检索结果以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及类药性（drug-likeness，DL）≥0.18[16]的2个吸收、分布、代谢、排泄（absorption, distribution, mentabolism, excretion，ADME）参数为条件对甘草入血成分进行初步筛选，得到其潜在活性成分及对应靶点信息。而后经STITCH数据库（http://stitch.embl.de/）设置置信度大于0.4，剔除不含相关信息化学成分，同时查阅《中国药典》2020年版和已发表的相关文献补充上述限制条件筛去或未预测到的甘草中含量较高、药理作用明确的主要活性成分。在TCMSP数据库中未查询到靶点的成分，通过PubChem数据库下载SDF格式文件，导入PharmMapper数据库（http:// lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html），设置Normal Fit值大于0.6，补充甘草成分靶点信息。将上述成分及靶点信息整合汇总去重后，将蛋白名靶点在Uniprot数据库中匹配为基因名称，即获得甘草的潜在活性成分及靶点。

以“nonalcoholic fatty liver disease”“obesity”为关键词分别进入GeneCards数据库（https://www.genecards.org）和TTD数据库（https://db.idrblab.net/ttd/），进行检索，搜集整理各数据库疾病靶点结果。在GeneCards数据库中，当预测靶点结果过多时，则可设定relevance score大于中位数的靶点为目标疾病的潜在靶点[17]。合并汇总各数据库结果，删去重复值取并集，由此获得NAFLD及肥胖的潜在靶点。

2.1.2 甘草治疗NAFLD及肥胖的关键靶点蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建 将整理好的甘草成分的药物靶点、NAFLD相关靶点及肥胖相关靶点导入jvenn在线作图软件平台做交集处理，绘制Venn图，三者的交集靶点即为甘草治疗NAFLD及肥胖的关键靶点。将交集得到的关键靶点提交至String在线平台（https://cn.string-db.org/），设定物种“Homo Sapiens”、最低相互作用阈值0.4，构建PPI网络，下载数据导入Cytoscape 3.9.1软件，进行拓扑分析，按度值排序构建关键靶点PPI网络。

2.1.3 甘草活性成分-NAFLD及肥胖关键靶点功能与通路的富集分析 将关键靶点上传至Metascape平台（https://metascape.org/），物种设定为“Homo Sapiens”，设置＜0.01进行基因本体（gene ontology，GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，下载保存数据结果，分别选择排名前10、20的条目采用bioinformatics在线绘图平台进行数据可视化。

2.1.4 “甘草活性成分-NAFLD及肥胖靶点-通路”网络构建 选择主要与NAFLD及肥胖相关的KEGG富集分析排名前20的信号通路，建立参与相关通路的成分及靶点之间的联系，导入Cytoscape 3.9.1构建“甘草活性成分-NAFLD及肥胖靶点-通路”的相互关系网络。对其进行网络拓扑参数分析，以度值排序，判断发挥药效的主要活性成分及核心作用靶点。

2.1.5 分子对接验证 将上述获得的前5个核心成分及核心靶点进行分子对接验证。小分子的3D结构从PubChem数据库下载获得，对接使用的核心靶点蛋白晶体结构从PDB数据库中下载获得，使用PyMol 2.5软件对所有蛋白进行处理，包括去除水分子，盐离子以及小分子，采用AutoDock Vina 1.1.2软件进行分子对接工作，PyMol 2.5以及Ligplus 2.2将对接结果进行可视化。

2.2 动物实验验证

2.2.1 分组、造模与给药 C57BL/6J雄性小鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组、模型组和甘草酸（150 mg/kg[18]）组，每组5只。对照组以含10%脂肪的常规饮食饲养，模型组和给药组以含60%脂肪的高脂饮食饲养，给药组隔日ip 0.3 mL甘草酸，对照组和模型组隔日ip等体积生理盐水，持续14周。

2.2.2 各组小鼠血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）水平和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性的测定 给药结束后称定质量，并于眼眶静脉丛取血，置试管中，室温放置30 min充分凝血，然后立即在4 ℃、3500 r/min离心获得血清，采用全自动生化分析仪检测血清中TC、TG水平和ALT、AST活性。

2.2.3 各组小鼠附睾白色脂肪和肝组织病理学观察 各组小鼠以异氟醚麻醉后处死，剥离肝脏、附睾白色脂肪组织，称定质量，用4%多聚甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋后切片（厚度4 μm），进行苏木素-伊红（HE）染色[19]，于显微镜下观察肝脏脂肪变性程度及附睾脂肪形态并拍照。

2.2.4 qRT-PCR检测各组小鼠肝脏组织、和mRNA表达 按照试剂盒说明书提取各组小鼠肝脏组织中总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析[19]。

2.2.5 Western blotting检测各组小鼠肝脏组织PPARG、CYP7A1和RXRA蛋白表达 取各组小鼠肝脏组织，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后分别加入PPARG（1∶200）、CYP7A1（1∶200）、RXRA（1∶200）和β-actin（1∶200）抗体，4 ℃孵育过夜后，加入HRP标记的IgG二抗（1∶5000），室温孵育1 h，电发光试剂盒显影，经蛋白凝胶成像仪进行曝光，采用Image J软件定量分析。

3 结果

3.1 甘草活性成分及靶点的获取、NAFLD及肥胖相关靶点的获取

通过TCMSP数据库检索甘草化学成分，共检索到280个化学成分，经ADME参数（OB≥30%、DL≥0.18）对甘草入血活性成分进行初步筛选，得到92个活性成分。然后经STITCH数据库置信度＞0.4剔除不含相关信息的成分，同时查阅相关文献补充重要化学成分，最终获得89个活性成分，具体信息见表1。从TCMSP数据库检索甘草各化学成分的靶点信息，并通过PharmMapper数据库预测补充缺乏靶点信息的化合物，整合去重后获得417个药物靶点。

基于Genecards数据库通过关键词搜索，共获得1195个NAFLD靶点、9842个肥胖靶点（Score值最大值为77.40，最小值为0.10）。Genecards数据库中的Score值越高说明该靶点与疾病密切关联，针对过多的肥胖靶点，通过设定Score值大于中位数，筛选得到1184个肥胖靶点。TTD数据库检索得到7个NAFLD靶点、81个肥胖靶点。合并去重后，获得1195个NAFLD靶点、1184个肥胖靶点。

3.2 甘草治疗NAFLD及肥胖的关键靶点PPI网络的构建

将甘草成分靶点与NAFLD靶点及肥胖靶点取交集，数据导入jvenn在线作图软件平台，绘制韦恩图，得到106个甘草治疗NAFLD及肥胖的关键靶点（图1-A），将交集靶点提交至String在线平台，下载蛋白相互作用数据，进一步通过Cytoscape 3.9.1进行拓扑分析，按度值排序构建类似同心圆的PPI网络（图1-B），该网络共包括106个节点，1961条边。节点表示蛋白，直线表示存在相互关系。节点的度值越大，在图中颜色越深，面积越大，说明有更多的蛋白与其发生相互作用，此节点蛋白在网络中的作用越重要。网络中关键节点蛋白主要是白蛋白（albumin，ALB）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL6）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、PPARG、IL1B（表2）。

表2 关键节点蛋白信息

3.3 关键靶点功能与通路的富集分析

采用Metascape数据平台对106个关键靶点进行生物学过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3部分的GO富集分析与KEGG通路富集分析。GO富集共得到1864个条目，BP包括对营养元素、激素、外源性物质刺激、脂质的应答，调节小分子代谢进程，炎症反应等共1647个，CC包括细胞膜、囊腔、内质网腔、胞外基质、血浆脂蛋白、常染色质等75个，MF包括信号受体、核受体、蛋白质二聚体激活，蛋白酶、激酶、羧酸、血红素、磷酸酶、类固醇结合等142个。分别根据值排序，选择排名前10的用气泡图展示（图2-A）。通路富集共得到包含癌症信号通路、脂质与动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、IL-17信号通路、缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信号通路、PPAR信号通路、T细胞受体信号通路在内的175个条目。说明甘草可能是通过多条通路达到治疗NAFLD及肥胖的作用，选择前20条通路用气泡图展示（图2-B）。

3.4 “甘草活性成分-NAFLD及肥胖靶点-通路”网络构建

根据参与前20条通路的成分及靶点之间的联系，采用Cytoscape 3.9.1构建“甘草活性成分-NAFLD及肥胖靶点-通路”网络（图3），共有188个节点，811条边。其中节点表示靶点或成分，直线表示相互作用，图中绿色方形表示关键靶点，橙色圆圈表示甘草活性成分，粉红色三角形表示通路。通过Cytoscape 3.9.1内置的Analyse Network对该网络进行拓扑参数分析，按度值排序，节点的度值越高，面积越大，颜色越深，说明此节点在网络中的作用越重要。通过分析发现，甘草活性成分中槲皮素（GC88）、甘草酸（GC89）、山柰酚（GC13）、柚皮素（GC14）和芒柄花素（GC11）度值、介度及紧密度均较高，说明这些成分极有可能是甘草治疗NAFLD及肥胖的核心成分，而前列腺素G/H合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、PPARG、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）及糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B）的度值、介度及紧密度在众多靶点中排名相对靠前，是主要的核心作用靶点，可以初步认为甘草主要通过调节这些核心靶点产生效果，具体信息见表3。以上这些结果也体现出了甘草通过多成分、多靶点、多通路发挥治疗NAFLD及肥胖的药理作用。

图2 甘草治疗NAFLD及肥胖关键靶点GO功能(A) 和KEGG通路(B) 富集分析

节点表示靶点或成分，直线表示相互作用，方形表示关键靶点，圆圈表示甘草活性成分，三角形表示通路；节点面积越大，颜色越深代表其度值越大，说明该节点越重要

表3 核心成分及靶点信息

3.5 分子对接验证

采用AutoDock Vina 1.1.2软件将上述“成分-靶点-通路”网络中筛选出的前5个核心成分（槲皮素、甘草酸、山柰酚、柚皮素和芒柄花素）及核心靶点PTGS2（PDB ID：5F19）、ESR1（PDB ID：7UJM）、PPARG（PDB ID：8DSY）、NOS2（PDB ID：1NSI）、GSK3B（PDB ID：4J1R）进行对接验证，得到各小分子化合物与大分子蛋白的结合能。通常认为结合能＜0，配体和受体能自发结合，结合能越低，亲和力越强，发生作用的可能性越大。将获得的各成分与靶点的结合能结果以热图展示（图4-A）。由结果可知，各结合能均＜−5 kJ/mol，均能自发结合，其中甘草酸与各靶点蛋白结合能明显较低，均＜−10 kJ/mol，显示出较强的亲和力。选择甘草酸与PTGS2、ESR1、PPARG的分子对接图进行可视化展示（图4-B～D）。

A-5个核心成分与靶点蛋白对接结合能热图 B～D-甘草酸配体分别与PTGS2蛋白、ESR1蛋白、PPARG蛋白的分子对接模式图（1-基于对接获得的配体-蛋白结合模式；2-小分子-蛋白的3D作用模式，黄色虚线为氢键作用；3-小分子-蛋白的2D作用模式，绿色虚线为氢键作用，红色样氨基酸为小分子周围产生弱相互作用的氨基酸-范德华力）

3.6 动物实验验证

上述分子对接实验表明甘草中的主要含量及活性成分甘草酸和各关键靶点蛋白显示出较强的结合能力，推测其可能是发挥抗NAFLD及肥胖的主要药效成分，进一步通过动物实验评价甘草酸药效。

3.6.1 甘草酸减轻高脂饮食小鼠体质量增加并抵抗肥胖 小鼠经14周高脂饮食喂养后，体质量和附睾白色脂肪质量均较对照组显著增加（＜0.05、0.001，图5-A、B），血清TC水平显著高于对照组（＜0.01，图5-C），TG水平较对照组有升高趋势（图5-D）。附睾白色脂肪形态较对照组明显增大，展现出肥胖表型（图5-E）。甘草酸能够显著减轻高脂小鼠体质量（＜0.05），减轻附睾白色脂肪堆积并减小脂肪形态（＜0.001），显著降低高脂小鼠血清TC含量（＜0.05），逆转TG升高现象。

3.6.2 甘草酸改善高脂饮食小鼠肝脏脂肪变性并防治NAFLD 高脂喂养14周后，病理组织学发现，高脂小鼠较对照组呈现出明显肝脏脂肪变性（图6-A），表明小鼠NAFLD模型成功，同时伴随肝功能下降，血清ALT、AST活性明显升高（＜0.01，图6-B、C）。甘草酸处理后能改善高脂小鼠肝脏脂肪变性程度，显著降低ALT、AST活性（＜0.01），改善小鼠肝功能。

3.6.3 甘草酸对高脂饮食小鼠肝脏组织PPARG信号通路的影响 PPAR信号通路在脂肪细胞分化、糖脂代谢、胰岛素抵抗和能量代谢方面发挥重要作用，与NAFLD及肥胖等代谢综合征关系密切[20]。核激素受体PPARG能控制脂肪酸的过氧化物酶体β-氧化途径，是脂肪细胞分化的关键调节因子。该受体调节基因转录的经典途径包括其通过与配体结合的初始激活即与RXR的异二聚化，其下游能调控肝脏胆汁酸合成限速酶，参与肝脏胆固醇代谢，进而影响机体脂代谢[21]。本研究根据网络药理学分析结果发现甘草防治NAFLD及肥胖的重要通路涉及PPAR信号通路，“成分-靶点-通路”网络中关键靶点涉及到PPARG及RXRA，与此同时，甘草酸也表现出与PPARG蛋白靶点的高亲和力。qRT-PCR实验结果显示甘草酸能显著激活高脂饮食小鼠肝脏及的mRNA表达（＜0.05，图7-A），研究进一步发现甘草酸能明显增加PPARG下游调节因子的mRNA表达水平（＜0.01）。Western blotting结果也表明甘草酸能显著增加高脂小鼠肝脏中RXRA、PPARG及CYP7A1蛋白表达水平（＜0.05，图7-B）。以上结果说明甘草可以通过其主要活性成分甘草酸发挥抗NAFLD及肥胖作用，而其潜在作用机制可能是甘草酸通过激活高脂饮食小鼠肝脏RXRA/PPARG/CYP7A1信号通路，进而影响机体脂代谢，发挥抗NAFLD及肥胖作用。

与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下图同

图6 甘草酸对高脂饮食小鼠肝脏HE染色(A) 及血清ALT (B)、AST (C) 活性的影响(, n = 5)

图7 甘草酸对高脂饮食小鼠肝脏RXRA/PPARG/CYP7A1信号通路基因(A) 及蛋白 (B) 表达的影响(, n = 5)

4 讨论

当下流行病学研究发现，快速发展的经济水平导致人们的饮食习惯与生活节奏发生变化，NAFLD及肥胖患病率逐年升高，呈流行趋势[2-3]。由于二者同属代谢性疾病，涉及的病理机制复杂，单一成分或靶点触发的通路较单一，往往只能改善部分指标，且易导致不良反应[1,4]。而中药具有多成分、多途径、多靶点协同作用的特点，可从多方面改善NAFLD及肥胖。本研究通过数据库检索，运用网络药理学方法构建了“甘草成分-靶点-信号通路”网络，辅以分子对接验证和动物实验评价药效，探讨甘草治疗NAFLD及肥胖的主要活性物质和潜在作用机制。

结果显示，筛选得到的甘草活性成分达89个，说明甘草成分种类繁多，药效物质基础复杂。成分靶点与疾病靶点结果显示，甘草和NAFLD及肥胖的交集靶点有106个，说明甘草在治疗NAFLD及肥胖方面的活性成分所影响的相关蛋白的生物学功能、分子功能和这2种疾病的发生、发展过程存在一定相关性。拓扑分析筛选得到的排名前5的活性成分依次为槲皮素、甘草酸、山柰酚、柚皮素和芒柄花素。研究发现，槲皮素可以通过恢复肠道菌群失衡，逆转相关内毒素血症诱导的Toll样受体4通路的激活，随后抑制炎症小体反应和网状应激通路的激活，进而导致脂质代谢基因表达紊乱来降低胰岛素抵抗和NAFLD活动度评分[22]。甘草酸可以通过降低肠道胆盐水解酶相关菌群丰度，增加结合胆汁酸，抑制肠道法尼酯X受体（farnesoid X-activated receptor，FXR），调节胆汁酸代谢，减轻高脂饮食诱导的小鼠体质量增加[15]。山柰酚可有效控制血糖，调节血脂及ALT、AST活性，抑制脂质生成基因过度表达[23]；转录组学和代谢组学分析也表明，山柰酚具有改善与能量代谢、脂质代谢、氧化应激和炎症相关的NAFLD的能力[24]。柚皮素可通过下调Kupffer细胞和肝细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路来预防NAFLD，从而减轻小鼠肝脏中的炎症[25]，也可以通过直接和间接激活AMPK来增加能量消耗和调节自噬来缓解NAFLD及肥胖[26]。芒柄花素可以有效调节肠道微生物群，改善宿主代谢和全身炎症，调节参与肥胖的特定肝脏miRNA的表达，并下调促炎细胞因子、和的mRNA表达水平来有效控制体质量、高血糖和胰岛素抵抗[27]；还可以激活AMPK，通过促进转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）介导的溶酶体生物发生和脂肪自噬来缓解肝脂肪变性[28]。PPI网络分析发现甘草防治NAFLD及肥胖的排名前5的核心靶点蛋白依次是PTGS2、ESR1、PPARG、NOS2及GSK3B，这些可能是甘草防治NAFLD及肥胖的重要靶点。PTGS2参与介导疼痛，在炎症反应中具有重要作用，研究发现选择性髓系细胞PTGS2缺失导致单核细胞募集和巨噬细胞增殖增加，导致促炎巨噬细胞增加，吞噬能力降低，致使体质量增加和肥胖，外周胰岛素敏感性和葡萄糖利用率降低，脂肪组织炎症和纤维化增加，脂肪组织血管生成异常[29]。类固醇激素受体ESR1在调节新陈代谢中起着重要作用，能介导肝脏对雌激素的反应。ESR1敲除雄性大鼠的肝转录组数据显示其参与碳水化合物和脂质代谢相关基因的表达改变[30-31]。核激素受体PPARG能促进脂肪细胞分化以增强血糖摄取[32]。NOS2是一种信使分子，参与炎症，增强促炎介质如IL-6、IL-8的合成[33]。GSK3B通过磷酸化PPARα-Ser280促进脂质合成代谢，延缓肥胖诱发的脂毒性心肌病发生发展[34-35]。动物和人类研究表明，甘草会影响血糖、血脂和血压[12]。棕色脂肪组织的主要功能是通过产热将多余的热量摄入消散成热能，增加能量消耗，而研究发现甘草提取物可以诱导脂肪细胞褐变，增加棕色脂肪表型有效减少肥胖，恢复代谢稳态[10]。富含甘草提取物的一种膳食补充剂可改善肠道菌群，增加肠屏障，降低Toll样受体介导的炎症通路抵抗高脂高蔗糖饮食诱导的NAFLD形成[11]。KEGG通路分析主要涉及脂质与动脉粥样硬化、胰岛素抵抗、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、AMPK信号通路、PPAR信号通路、T细胞受体信号通路。这些文献研究及网络分析结果充分说明，甘草可通过多成分、多靶点、多通路协同发挥防治NAFLD及肥胖的作用。

将筛选得到的甘草中的主要活性成分和关键靶点蛋白进行分子对接，结果显示这些小分子成分都能自发较好地结合到关键靶蛋白的多个氨基酸残基上，验证了网络药理学的筛选结果。同时发现甘草酸成分和各靶点蛋白均具有较强的亲和力，且其为甘草中主要含量及活性成分，提示其可能在甘草发挥抗NAFLD及肥胖方面贡献较大，其中甘草酸展现出与PPARG之间较强的结合力。PPARG作为一种核激素配体激活受体，其经典途径通过与RXR的异二聚化激活该信号通路，调控下游胆汁酸合成限速酶[21]，胆汁酸在肝脏中由胆固醇主要通过经典途径合成，该途径通过CYP7A1起始催化[36]。因此，这些限速酶能介导肝脏胆固醇转化生成胆汁酸，从而影响胆汁酸代谢和胆固醇消耗，调控脂质代谢，参与代谢性疾病发生发展。基于网络药理研究与分子对接结果，进一步运用动物实验评价了甘草酸对高脂饮食小鼠的药效活性，并从基因及蛋白水平上发现甘草酸能通过激活高脂饮食小鼠肝脏RXRA/PPARG信号通路，继而活化下游CYP7A1，改善机体血清TC、TG代谢，降低血清ALT、AST活性，防治NAFLD，抵抗肥胖（图8）。分子对接显示甘草酸能与PPARG等靶点蛋白结合，表明其可能直接激活或抑制该靶点蛋白，Western blotting实验结果发现甘草酸能显著抑制高脂饮食小鼠肝脏中这些靶点蛋白的减少，相应增加其表达，这也进一步佐证了分子对接的结论。本研究同时发现甘草酸也能显著促进高脂小鼠这些靶蛋白的mRNA转录水平，说明甘草酸可能一方面能直接抑制高脂小鼠PPARG等靶点蛋白的减少，另一方面还可能通过其他通路参与并调控这些靶点蛋白基因上游的某些或某个分子来增加高脂小鼠体内这些靶点的mRNA转录水平，而其具体调控机制仍需实验探索验证。这些结果也反映出甘草酸这单一成分可能通过多靶点、多通路来发挥抗NAFLD及肥胖作用。

图8 甘草酸防治NAFLD及肥胖的潜在机制

综上，本研究基于网络药理学和整合生物信息学方法较为系统地分析预测了甘草防治NAFLD及肥胖的主要生物活性成分及潜在作用机制，通过结合当前相关文献研究结果进行印证，并采用分子对接方法验证了预测的关键活性成分与核心靶点蛋白之间的结合能力。动物实验结果揭示了重要活性成分甘草酸能通过调节肝脏PPARG信号通路产生抗NAFLD及肥胖的作用，进一步证实了网络药理学预测及分子对接的可靠性。然而，本研究得出的潜在作用机制仅局限于在动物基因及蛋白水平上，后续还需要更多的临床试验来进一步证实这些结论；与此同时，本实验也仅仅选用了其中的主要含量及活性成分甘草酸进行药效学验证，未能充分研究甘草防治NAFLD及肥胖的其他主要活性成分的药效作用和其他靶点通路的变化。总的来说，本研究将为促进传统中药甘草及其主要活性成分甘草酸的临床应用与机制研究提供科学依据，也为病机复杂且诱因相同的NAFLD及肥胖等代谢性疾病的防治思路提供参考借鉴。而具有“多成分、多靶点、多通路”作用特点的中药甘草防治NAFLD及肥胖的后续作用机制研究仍任重而道远。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Mechanism ofet Rhizoma against non-alcoholic fatty liver disease and obesity based on network pharmacology and experimental verification

LI Yun1, LIU Tian-yu2, YUAN Heng-jie1, LI Zheng-xiang1

1. Department of Pharmacy, General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China 2. Department of Gastroenterology, General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

To explore the active ingredients, targets and potential mechanism of Gancao (et) in the prevention and treatment of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and obesity based on network pharmacology and experimental verification.The main chemical active constituents and their action targets ofetwere screened by TCMSP database combined with published literature, and the targets of NAFLD and obesity were obtained from GeneCards database. The protein-protein interaction (PPI) network was following analyzed and constructed using String platform and Cytoscape 3.9.1 software, respectively. Then, the intersection targets were analyzed by Metascape platform, and gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis were performed. In addition, Cytoscape 3.9.1 software was used again to construct the “component ofet-disease target-pathway” network. Molecular docking was further used to verify the binding ability and affinity between the predicted key components and targets. And finally, the regulatory effect of key components on the target pathway was confirmed by animal experiments.etmainly acted on key targets such as prostaglandin G/H synthase 2 (PTGS2), estrogen receptor 1 (ESR1), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG), nitric oxide synthase 2 (NOS2) and glycogen synthase kinase-3 beta (GSK3B) through core active components like quercetin, glycyrrhizic acid, kaempferol, naringin and formononetin. And it might prevent and treat NAFLD and obesity via lipid and atherosclerosis, insulin resistance, adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) signaling pathway, PPAR signaling pathway, T cell receptor signaling and other pathways. The active ingredient glycyrrhizic acid could alleviate liver steatosis, dramatically reduce weight gain (< 0.05), observably improve blood lipid level as well as liver function (< 0.05, 0.01), and significantly increase both hepatic mRNA and protein expressions of retinoic acid receptor RXR-alpha (),and cholesterol 7α-hydroxylase () in high fat diet mice (< 0.05, 0.01).etcould effectively intervene in NAFLD and obesity with the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway. And its main active ingredient glycyrrhizic acid could play a role in anti-NAFLD and obesity by activating hepatic RXRA/ PPARG/CYP7A1 signaling pathway in high fat diet mice.

network pharmacology;et; nonalcoholic fatty liver disease; obesity; high fat diet mice; glycyrrhizic acid; naringin; formononetin; RXRA/PPARG/CYP7A1 signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)15 - 4882 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.014

2023-03-13

国家自然科学基金资助项目（82100574）；天津市卫生健康科技项目（TJWJ2022QN010）

李 云，女，硕士，主管药师，研究方向为消化性疾病中药药物药理。Tel: 18322186706 E-mail: 15210690439@163.com

通信作者：李正翔，男，本科，主任药师，硕士生导师，研究方向为医院药学与临床药理学。E-mail: 13820893896@163.com

[责任编辑 李亚楠]