德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞抗炎作用的研究*

周金萍，罗 程，李海燕，林秋叶

(云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201)

人体的免疫系统调控着机体健康的稳定与平衡，能够帮助机体抵御病原微生物及其他抗原入侵，但过强或异常的免疫反应反而会损伤机体。机体在受到某些胞内寄生病原体、化学物质和组织抗原等刺激后，会激活不同信号通路产生细胞因子和炎性介质，在组织损伤或病原体存在的局部造成炎性渗出，发挥杀菌作用；同时，炎症反应产物又可以活化和聚集更多的巨噬细胞和自然杀伤细胞等到达炎症反应部位，增强其对病原体的吞噬和杀伤作用[1]。但是，当炎症反应的调节发生异常时，会产生过量细胞因子或促炎性介质，从而对机体造成一定程度的损伤[2]。

茶叶是山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaLinn.)植物的嫩叶，根据其发酵程度不同可分为不发酵茶、半发酵茶和全发酵茶[3]。酸茶是一种厌氧发酵茶，味道清新、口味回甘且具有独特的酸香味，故而得名酸茶[4-5]，主要产于中国云南、泰国北部、缅甸、老挝以及日本德岛县[5-8]。近年来研究发现：酸茶富含茶多酚、糖类、蛋白质、黄酮类、咖啡碱和氨基酸等多种活性物质[9-11]，并具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗肿瘤和肝保护等多种生物学功效[12-13]。乳酸菌作为酸茶发酵过程中的优势菌，对茶多酚类活性成分的含量、组成及活性变化有重要影响，且研究发现酸茶乳酸菌具有良好的益生功能[14-15]。德昂酸茶是云南德昂族一种具有民族特色的发酵茶制品，采摘新鲜茶叶，经过冲洗、晾晒、蒸茶和揉茶后装入龙竹筒，压实，用芭蕉叶封口，埋在干燥阴凉的地下进行厌氧发酵。在德昂族的日常生活中，酸茶通常作为小吃食用或直接泡水饮用。在德昂族民间传说中，常饮酸茶可美容增寿、清热解暑、消炎解酒、爽神润喉和增进消化[16]。研究发现：泰国酸茶Miang 提取物对脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)和干扰素-γ (interferon-γ，IFN-γ)诱导RAW-264.7 细胞产生的炎症调节因子NO 具有抑制作用[17]，表明酸茶具有抗炎作用。然而，国内外对德昂酸茶的研究主要以文化研究为主，其抗炎功效鲜见报道。

本研究以小鼠RAW264.7 巨噬细胞为研究对象、LPS 和IFN-γ 诱导的小鼠RAW264.7 巨噬细胞为炎症模型、NF-κB 关键炎症信号通路为靶点，研究德昂酸茶水提物对小鼠巨噬细胞NFκB 信号通路活化和炎症因子表达的影响，旨在揭示德昂酸茶对小鼠RAW264.7 巨噬细胞NFκB 信号通路活化的抗炎机制。研究结果可为阐明德昂酸茶的免疫调节功效机制奠定理论基础，对促进酸茶产业发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

德昂酸茶(新鲜茶叶采摘后厌氧发酵3 个月)，采自云南省德宏州芒市三台山德昂族乡；小鼠RAW264.7 巨噬细胞系(KCB 200603YJ)由中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库提供。

高糖 DMEM 培养基、0.25%胰酶[ 含0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)]、dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自ABI 公司；LPS (Escherichia coli055:B5)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、青霉素和链霉素购自Sigma-Aldrich 公司；小鼠IFN-γ、兔抗IKKα抗体和兔抗IκBα 抗体购自Abcam 公司；兔抗βactin 抗体和HRP-山羊抗兔IgG (H+L)二抗购自Proteintech 公司；兔抗Phospho-IKKα/β 抗体和兔抗Phospho-IκBα 抗体购自CST 公司；总RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒和Pro-light HRP 化学发光检测试剂购自天根生化科技有限公司；Griess 试剂盒购自Promega 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；噻唑兰[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]、高效 RIPA 组织/细胞裂解液和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS) 购 自Amresco 公司；5×蛋白上样缓冲液购自Biosharp 公司；蛋白预染 Marker 购自Fermentas 公司；核酸染料Gelview 购自百泰克生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ELX-808 多功能酶标仪，美国伯腾公司；Sorvall ST 16R 高速冷冻离心机，美国Thermo 公司；NP80Touch 超微量分光光度计，德国IMPLEN 公司；Bio-RADiCycler 实时荧光定量PCR 仪、Trans-Blot Turbo 蛋白转膜仪和Bio-Rad 电泳仪，美国Bio-Rad 公司；SCIENTZ-18N 冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SHELLAB2406-2型二氧化碳培养箱，美国SHELLAB 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 德昂酸茶水提物制备及儿茶素含量测定

取德昂酸茶5 g，加入超纯水300 mL 煮沸5 min，然后用滤纸过滤，重复3 次，混合3 次滤液，-20 ℃冻结，-80 ℃真空冷冻干燥，得到德昂酸茶水提物冻干粉，并将其样品送至中国科学院昆明植物研究所检测儿茶素含量。HPLC 检测条件为：色谱柱ZORBAX SB-C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温40 ℃，流速1 mL/min，检测波长280 nm，进样量5 μL；流动相A：2%甲酸—水溶液，流动相B：乙腈；梯度程序：0～5 min，92% A；5～23 min，92%～75% A；23～25 min，75%～92% A。酸茶提取物中表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的含量分别为57.63、6.28、56.61、33.81 和13.86 mg/g。德昂酸茶提取物冻干粉用超纯水配制成质量浓度为31.3、62.5、125.0、250.0、500.0 和1 000.0 μg/mL的酸茶水提物溶液，用0.22 μm 无菌过滤膜过滤，-20 ℃避光保存待用。

1.3.2 小鼠RAW264.7 巨噬细胞培养和分组

将小鼠RAW264.7 巨噬细胞培养于DMEM完全培养基(含体积分数10% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素)中，置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。当培养皿中细胞覆盖率至80%时，用 0.25%胰酶消化细胞获得细胞悬液，将细胞悬液接种到细胞培养板中，细胞贴壁后弃去培养基，用DPBS 清洗后进行分组处理。以只加DMEM 完全培养基为对照组，只加德昂酸茶水提物为酸茶水提物处理组，只加含100 ng/mL LPS 和10 ng/mL IFN-γ 的DMEM 完全培养基为炎症组，炎症组中加入德昂酸茶水提物为处理组。每组设3 个重复孔，分组后细胞在5% CO2、37 ℃培养箱中培养。

1.3.3 细胞活力检测

将细胞(1×105/孔)接种到96 孔细胞培养板中，每孔分别加入含不同质量浓度德昂酸茶水提物的DMEM 完全培养基200 μL，以只加DMEM完全培养基为对照组；培养24 h 后每孔加入MTT 溶液20 μL 并继续培养4 h，吸弃上清液，再加入DMSO 150 μL，于摇床上低速振荡 10 min，使蓝紫色结晶物充分溶解；在酶标仪OD490nm处测定各孔的吸光度，计算细胞活力。

1.3.4 NO 含量的测定

将细胞(1×105/孔)接种到96 孔细胞培养板中，处理组每孔加入含不同质量浓度德昂酸茶水提物的DMEM 完全培养基200 μL，培养24 h，采用Griess 试剂盒检测细胞培养上清液中NO2-的含量，拟合NO 反应标准曲线，计算NO 含量。

1.3.5 实时荧光定量检测炎症基因及NF-κB 信号通路基因的mRNA 表达水平

将细胞(1×106/孔)接种到6 孔细胞培养板中，用于检测炎症基因mRNA 表达水平的处理组每孔加入含不同质量浓度德昂酸茶水提物的DMEM 完全培养基2 mL，培养6 h；用于检测NF-κB 信号通路基因mRNA 表达水平的处理组每孔加入1 000 μg/mL 德昂酸茶水提物2 mL，培养6 h。

将上述培养的细胞弃去培养基后用DPBS洗2 遍，收集细胞，利用总RNA 提取试剂盒提取细胞总RNA，并测定RNA 纯度及含量，根据反转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA。荧光定量反应体系包括2×SuperReal PreMix Plus 10.0 μL，10 μmol/L 正向和反向引物各0.6 μL，cDNA 2.0 μL，RNase Free dH2O 6.8 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃变性30 s，40 个循环。引物序列见表1。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR sequence of primers

1.3.6 蛋白质免疫印迹(Western-blotting)分析

将细胞(1×106/孔)接种到6 孔细胞培养板中，加入DMEM 完全培养基2 mL 培养48 h 后，分为对照组、炎症组、处理组和酸茶水提物处理组。处理组为向炎症组中每孔加入含1 000 μg/mL德昂酸茶水提物的DMEM 完全培养基2 mL；酸茶水提物处理组则加入含1 000 μg/mL 德昂酸茶水提物的DMEM 完全培养基2 mL，培养15 min。

将培养好的细胞弃去培养基，用DPBS 清洗1 次，加入细胞裂解液裂解后，4 ℃、10 360 r/min离心5 min，收集上清液，采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量。使用SDS-PAGE 分离蛋白质样品后，转移到聚偏氟乙烯膜(PVDF 膜)上，用5%脱脂奶封闭1 h，用TTBS 洗膜3 次，放入加有一抗(兔抗β-actin 抗体、兔抗IKKα 抗体、兔抗IκBα 抗体、兔抗Phospho-IKKα/β 抗体和兔抗Phospho-IκBα 抗体)的平皿中侧摆摇床4 ℃低速孵育8～12 h；TTBS 洗膜3 次，然后将漂洗过的PVDF 膜放入加有二抗[HRP-山羊抗兔IgG (H+L)]的平皿中，避光室温孵育1 h，TTBS洗膜3 次后使用Pro-light HRP 化学发光检测试剂进行显色。

1.4 统计学分析

Western-blotting 数据采用Image J 软件处理，测量条带光密度值，试验数据采用目的蛋白条带光密度值与内参条带光密度值的比值表示。数据采用SPSS 18.0 软件进行单因素方差分析，组间比较采用Duncan’s 分析，基因表达量差异数据采用Studentt-test 分析。结果用“平均值±标准差”表示，显著水平设置为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7 巨噬细胞活力的影响

由图1 可知：与对照组相比，各质量浓度的德昂酸茶水提物处理组细胞活力无显著差异(P＞0.05)，表明德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7 巨噬细胞没有细胞毒性作用。

图1 德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞细胞活力的影响Fig.1 Effect of aqueous extract of De’ang pickled tea on the cell viability of murine RAW264.7 macrophages

2.2 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ 诱导小鼠RAW-264.7 巨噬细胞NO 产生的影响

由图2 可知：与对照组相比，炎症组(L/I)的NO 质量浓度显著升高(P＜0.05)，31.3、62.5、125.0、250.0、500.0 和1 000.0 μg/mL 德昂酸茶水提物对NO 的抑制率分别为 5.13%、12.13%、25.20%、50.32%、68.94% (P＜0.05)和67.80% (P＜0.05)，表明德昂酸茶水提物可显著抑制LPS/IFNγ 诱导小鼠RAW264.7 巨噬细胞NO 的产生，且呈剂量依赖性。

图2 德昂酸茶水提物对小鼠RAW264.7巨噬细胞NO 产生的影响Fig.2 Effects of aqueous extract of De’ang pickled tea on the NO production by murine RAW264.7 macrophages

2.3 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ 诱导小鼠RAW-264.7 巨噬细胞炎症基因mRNA 表达水平的影响

由图3 可知：与对照组相比，炎症组(L/I)小鼠RAW264.7 巨噬细胞INOS、COX2、IL1β和IL6的mRNA 表达水平显著增加(P＜0.05)；与L/I 组相比，125.0～1 000.0 μg/mL 德昂酸茶水提物可显著抑制LPS/IFN-γ 诱导的小鼠RAW264.7 巨噬细胞中INOS的mRNA 表达量(P＜0.05)；1 000.0 μg/mL 酸茶水提取物可显著抑制LPS/IFN-γ 诱导的COX2和IL1β的 mRNA 表达量 (P＜0.05) ；500.0～1 000.0 μg/mL酸茶水提取物可显著抑制LPS/IFN-γ 诱导的IL6的mRNA 表达量。表明德昂酸茶水提物可抑制LPS/IFN-γ 诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞的炎症因子mRNA 表达，并选择1 000.0 μg/mL 德昂酸茶水提物开展后续试验。

图3 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ 诱导小鼠RAW264.7 巨噬细胞炎症基因mRNA 表达水平的影响Fig.3 Effect of aqueous extract of De’ang pickled tea on the mRNA expression level of inflammatory gene in RAW264.7 macrophages of murine

2.4 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ 诱导小鼠RAW-264.7 巨噬细胞NF-κB 信号通路基因mRNA 表达水平的影响

由图4 可知：与对照组相比，炎症组(L/I)小鼠RAW264.7 巨噬细胞RELB、NFKB2、NFK-BIA、IKBKE和TNFAIP3的mRNA 表达水平显著增加(P＜0.05)；与L/I 组相比，1 000.0 μg/mL德昂酸茶水提物处理后，LPS/IFN-γ 诱导的小鼠RAW264.7 巨噬细胞NF-κB 信号通路负调控因子NFKBIA和TNFAIP3的mRNA 表达量均显著上升(P＜0.05)。表明德昂酸茶水提物可通过上调负调控因子基因的表达抑制LPS/IFN-γ 诱导小鼠RAW 264.7 巨噬细胞NF-κB 信号通路活化。

图4 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ 诱导RAW264.7 巨噬细胞NF-κB 信号通路基因表达的影响Fig.4 Effect of aqueous extract of De’ang pickled tea on the gene expression of NF-κB signaling pathway in murine RAW264.7 macrophages induced by LPS/IFN-γ

2.5 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ 诱导小鼠RAW-264.7 巨噬细胞NF-κB 信号通路蛋白表达的影响

由图5 可知：与空白对照组相比，炎症组(L/I)小鼠RAW264.7 巨噬细胞中pIKKα/IKKα 和pIκBα/IκBα 蛋白比值显著增加(P＜0.05)，而酸茶水提物处理组无显著变化(P＞0.05)；与L/I 组相比，LPS/IFN-γ+酸茶水提物组的pIKKα/IKKα 和pIκBα/IκBα 蛋白比值显著降低(P＜0.05)。表明德昂酸茶水提物可显著抑制LPS/IFN-γ 诱导的小鼠RAW264.7 巨噬细胞NF-κB 信号通路上游激酶IKKα 蛋白的磷酸化和抑制蛋白IκBα 的磷酸化。

图5 德昂酸茶水提物对LPS/IFN-γ 诱导小鼠 RAW264.7 巨噬细胞NF-κB 信号通路蛋白表达的影响Fig.5 Effects of aqueous extract of De’ang pickled tea on the phosphorylation of key upstream kinases in RAW264.7 macrophages induced by LPS/IFN-γ

3 讨论

巨噬细胞属于一种免疫效应细胞，常处于静止状态，当受到LPS 等免疫刺激物刺激后被激活，参与免疫应答[18]。核转录因子NF-κB 对来自免疫受体的信号作出反应，并导致快速但短暂的NF-κB 活化，NF-κB 可高效诱导多种细胞因子(如INOS、COX2、IL1β和IL6等)基因的表达。INOS 在机体中可诱导产生炎症调节因子NO，但其过度表达或失调会导致NO 含量过高，引起毒性效应，并与感染性休克、心功能不全、疼痛、糖尿病和癌症等疾病相关[19]。因此，调节INOS的表达和NO 的合成被认为是治疗炎症疾病的重要途径[20]。COX2 是产生前列腺素的关键酶[21]，在组织损伤和炎症等情况下表达增强，促进前列腺素的产生，前列腺素通过激活酪氨酸激酶受体促进肿瘤增殖、血管生成和最终转移[22]。在炎症反应中，促炎因子IL1β 和IL6 表达增强，可以增加诱发类风湿性关节炎、哮喘和炎症性肠病的风险[23]。本研究显示：31.3～1 000.0 μg/mL 德昂酸茶水提物可显著降低LPS/IFN-γ 诱导的小鼠RAW264.7 巨噬细胞产生NO；1 000.0 μg/mL 德昂酸茶水提物可显著抑制LPS/IFN-γ 诱导小鼠RAW264.7 巨噬细胞的炎症因子INOS、COX2、IL1β和IL6基因表达，并增加NF-κB 信号通路负调节因子NFKBIA和TNFAIP3的基因表达。表明德昂酸茶水提物可以通过调控炎症基因和NFκB 信号通路关键基因的表达发挥抗炎作用。

为了进一步研究德昂酸茶水提物对小鼠RAW-264.7 巨噬细胞的抗炎作用机制，对NF-κB 信号通路关键上游激酶蛋白和抑制蛋白的表达进行了检测。经典NF-κB 细胞内信号传导途径的第1 步是激活TGFβ1，然后又激活三聚体IκB 激酶(IκB kinase，IKK)复合物，IKK 复合体会磷酸化IκBα或其他IκB 家族成员，磷酸化的IκB 家族成员发生泛素化和蛋白酶体降解，导致NF-κB 家族成员的释放和核易位，引发炎症反应[24-26]。本研究显示：1 000.0 μg/mL 德昂酸茶水提物可降低LPS/IFN-γ 诱导的小鼠RAW264.7 巨噬细胞 pIκBα/IκBα蛋白和pIKKα/IKKα 蛋白比值，表明德昂酸茶水提物可以通过抑制小鼠RAW264.7 巨噬细胞IκBα和IKKα 的磷酸化阻断NF-κB 信号通路活化。

对德昂酸茶儿茶素含量的测定中发现德昂酸茶儿茶素含量显著高于普洱茶中儿茶素含量[11]，儿茶素可能是德昂酸茶发挥抗炎作用的重要成分。LYU 等[27]研究发现：表没食子儿茶素对LPS诱导的小鼠RAW264.7 巨噬细胞产生的NO 有抑制作用，且效果优于表没食子儿茶素没食子酸酯，而表儿茶素可降低LPS 诱导的RAW264.7 细胞的NF-κB 表达，且呈剂量依赖性[28]。

4 结论

德昂酸茶水提物能够调控LPS/IFN-γ 诱导小鼠RAW264.7 巨噬细胞的NF-κB 信号通路，通过抑制IκBα 磷酸化降解和IKKα 活化以及增加NFκB 信号通路负调控因子基因表达，降低炎症因子的基因表达水平，进一步抑制NO 产生，减轻炎症反应。本研究可为功能性德昂酸茶产品的进一步开发利用提供理论依据。