雌激素相关受体a对脑胶质瘤细胞耐受替莫唑胺的影响

张留弟 王天笑 陈海飞 李群益 施孝金

摘 要 目的：探究雌激素相关受体a对脑胶质瘤细胞耐受替莫唑胺（temozolomide，TMZ）的调控作用及其机制。方法：建立耐受TMZ的胶质瘤细胞株，并构建胶质瘤裸鼠移植模型；从离体和在体层面分析特异性敲减ERRa或使用ERRα反向激动剂XCT790对耐药胶质瘤细胞增殖的影响；并结合荧光定量PCR实验检测Wnt通路相关基因的表达。结果：敲减ERRα或给予XCT790均显著抑制耐药胶质瘤细胞增殖，并抑制Wnt5a信号通路关键基因的表达，动物模型中XCT790联用TMZ可有效抑制耐受TMZ的胶质瘤细胞生长。结论：抑制ERRa功能可逆转胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药性，这一作用可能与抑制Wnt5a信号通路的功能密切相关。

关键词 雌激素相关受体a 胶质瘤 替莫唑胺 XCT790 Wnt5a

中图分类号：R73-3； R739.41 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2023）11-0051-05

引用本文 张留弟， 王天笑， 陈海飞， 等. 雌激素相关受体a对脑胶质瘤细胞耐受替莫唑胺的影响[J]. 上海医药， 2023， 44（11）： 51-55.

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81973399）；国家自然科学基金青年科学基金项目（81901399）；上海市卫生健康委员会科研基金项目（20184Y0194， 20204Y0445）

Effect of estrogen-related receptor α on temozolomide resistance in glioma cell

ZHANG Liudi， WANG Tianxiao， CHEN Haifei， LI Qunyi， SHI Xiaojin

（Department of Pharmacy， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the regulatory effect and mechanism of estrogen-related receptor a （ERRa） on temozolomide resistance in glioma cells. Methods： A temozolomide （TMZ） resistant glioma cell line and a nude mouse model of glioma orthotopic transplantation were established. The effects of specific ERRa knockdown or the use of the ERRα reverse agonist XCT790 on the proliferation of TMZ-resistant glioma cells were analyzed in vitro and in vivo. The expression of Wnt pathway-related genes was detected by fluorescence quantitative PCR. Results： Knocking down ERRa or administration of XCT790 could significantly inhibit the proliferation of TMZ-resistant glioma cells and the expression of the key genes in Wnt5a signaling pathway， and prolong the survival period of model animals. Conclusion： Inhibition of ERRa function can reverse TMZ resistance in glioma cells， which may be closely related to inhibiting the function of Wnt5a signaling pathway.

KEY WORDS estrogen related receptors a； glioma； temozolomide； XCT790； Wnt5a

腦胶质瘤是成年人颅内最常见、恶性程度最高及预后情况最差的肿瘤[1]。其中胶质母细胞瘤（glioblastoma， GBM， WHO Ⅳ级）是恶性程度最高的脑胶质瘤，发病率约为3.2/10万，在所有胶质瘤患者中占46.1%[2]。目前治疗方案以手术切除为主。但由于胶质瘤细胞生长迅速，侵袭能力强，与正常脑组织无明显界限，且瘤体分布较为分散，手术很难彻底清除肿瘤病灶，因此术后须结合放化疗。在临床化疗用药中，替莫唑胺（temozolomide， TMZ）的应用最为广泛。TMZ为咪唑并四嗪类具有抗肿瘤活性的第二代口服烷化剂，是目前临床治疗脑胶质瘤的标准一线化疗药[3]。多项国际大型随机对照研究证实，胶质瘤患者手术后服用TMZ同步进行放化疗，相比于术后单纯放疗的病人，中位数生存期由12个月提高到14.6个月，其中部分患者术后生存期达到5年以上[4-5]。证实了术后通过化疗可以进一步杀灭残存肿瘤细胞，有助于提高患者无进展生存期和总生存期。然而在临床治疗过程中后期，部分患者对替莫唑胺的敏感性逐渐降低，肿瘤复发概率提升，导致疾病根治难度加大[6]。因此，寻找一种有效降低胶质瘤患者对TMZ耐药性的方案对肿瘤治疗和延长患者生存周期至关重要。

雌激素相关受体a（estrogen-related receptor a，ERRa）在体内广泛表达，参与调控组织器官发育、细胞衰老、肿瘤发生和发展等[7]。近年来，大量研究揭示ERRα的表达与乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胃腺癌和胶质瘤等肿瘤疾病的发生发展和临床预后密切相关[8-9]。杜克大学的McDonnell等[10]的研究证实，ERRa反向激动剂可以抑制线粒体的功能从而抑制乳酸的利用，特异性导致肿瘤细胞的持续凋亡，并显著增敏PI3K抑制剂或者PI3K/mTOR双重抑制剂的体内抗肿瘤活性，因此，联合应用ERRa拮抗剂/反向激动剂可能成为新的抗肿瘤治疗策略。本研究拟通过建立耐受TMZ的胶质瘤细胞株，并构建胶质瘤裸鼠原位移植模型；从细胞到动物层面评估特异性敲减ERRa或使用ERRa反向激动剂XCT790对逆转胶质瘤细胞耐受TMZ的潜力，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞和动物

人类神经胶质瘤细胞系U87和U251购自中国科学院细胞库。构建胶质瘤裸鼠原位移植模型所用雄性裸鼠（BALB/c nude）购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

1.1.2 试剂

XCT 790（HY-10426）、TMZ（HY-17364）均购自MedChemExpress公司；上海吉凯基因生物技术有限公司提供了本研究使用的ERRα敲减慢病毒载体和阴性对照品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

两种胶质瘤细胞均在添加10%澳洲胎牛血清（翌圣生物科技有限公司）和100 U/mL青霉素/链霉素（碧云天生物技术有限公司）的最低必需培养基（中桥新舟生物技术有限公司）中培养。细胞在含有5% CO2和95%空气的湿化培养箱中于37 ℃培养。

为了探究ERRα对耐受TMZ的神经胶质瘤细胞的治疗作用，我们参考先前研究建立耐受TMZ的胶质瘤细胞系[11]。U87和U251细胞分别用低浓度TMZ（10 mmol/L）作为初始浓度，TMZ剂量每2周增加1倍，直到药物浓度达到640 mmol/L。

1.2.2 细胞活力测定

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Proteintech Group公司）进行细胞活力测定。将胶质瘤细胞以6×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并在标准培养条件下孵育24 h。药物处理后，将10 μL/孔CCK-8试剂加入96孔板中，并在37 ℃下孵育1 h。使用多功能酶标仪在450 nm处检测光密度（OD）值。每个实验均独立进行了3次，每次实验有5份重复。

1.2.3 荧光定量PCR测定

胶质瘤细胞实验处理后，利用RNA提取试剂盒（康为生物技术有限公司）从细胞中分离总RNA。使用逆转录试剂盒（Takara生物技术公司）将2 mg总RNA逆转录成cDNA。并在ABI 7500 PCR系统（Applied Biosystems公司）中使用SYBR Green PCR试剂盒（Takara生物技术公司）进行定量实时逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）反应。为了标准化检测基因的表达水平，利用GAPDH基因作为内参进行检测。检测基因的引物序列设计参考RTPrimerDB数据库 （http：//medgen.ugent. be/rtprimerdb/）。

1.2.4 建立胶质瘤裸鼠异种移植模型

雄性BALB/c裸鼠（6～8周龄，22 g）背部皮下注射2×106个U87 TMZ耐药细胞，建立胶质瘤异种移植模型。胶质瘤细胞植入后每天给予药物治疗，并在第5天开始，每隔5 d记录瘤体生长情况并绘制肿瘤生长曲线，移植瘤体积[V（cm3）]=0.5×L×S2（L，移植瘤最大长径cm，S移植瘤横径cm）。实验开始后第30天处死动物对瘤体进行称重。

1.2.5 统计学分析

使用GraphPad Prism 7.0和SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。单因素方差分析和Dunnetts post-hoc检验比较实验中的组间差异。在分析之前，所有数据都经过了Kolmogorov-Smirnov正态性检验和Levene检验。Compusyn软件用于绘制Chou-Tallay等剂量图评估XCT790与TMZ联合用药的协同作用。数据以平均值±标准差表示。P<0.05提示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 建立胶质瘤TMZ耐药细胞株

TMZ已被证实是胶质瘤的一线化疗药物，可以延长患者生存期。然而，连续使用TMZ治疗引起的获得性化疗抵抗严重限制了治疗效果，成为胶质瘤患者治疗失败的主要原因。我們通过长期给予梯度增高的TMZ，建立对TMZ耐药的胶质瘤细胞株。并利用CCK-8检测TMZ在亲本细胞和耐药细胞中IC50的变化情况。结果显示，U87亲本细胞TMZ IC50为796 mmol/L，而耐药细胞TMZ IC50达到了2 314 mmol/L，提高了约2.9倍；U251亲本细胞TMZ IC50为434 mmol/L，耐药细胞TMZ IC50为1 138 mmol/L，提高了约2.6倍（图1）。这些结果证实我们成功建立了对TMZ耐药的胶质瘤细胞株。

2.2 敲减ERRα逆转胶质瘤细胞对TMZ的耐药性

在已建立的对TMZ耐药的胶质瘤细胞基础上，我们利用慢病毒转染的手段，特异性敲减耐药细胞株的ERRα表达，并观察敲减ERRα是否影响TMZ的治疗效果。结果显示，敲减ERRα后，U87 TMZ耐药细胞的TMZ IC50降低了45.6%，而U251 TMZ耐药细胞的TMZ IC50降低了35.5%（图2），证实敲减ERRα可显著逆转胶质瘤细胞对TMZ的耐药性。

2.3 XCT790与TMZ联合用药对胶质瘤治疗具有协同作用

之前的研究结果已经敲减ERRα可有逆转胶质瘤细胞对TMZ的耐药性，我们推测ERRα特异性反向激动剂XCT790与TMZ联合治疗耐药胶质瘤细胞能发挥协同作用，并采用了Chou-Talay联合用药协同分析方案来评估协同作用效果。利用梯度浓度XCT790和指定浓度的TMZ处理胶质瘤细胞24 h，组合指数（CI）小于1表明XCT790和TMZ的组合具有协同作用。结果显示，XCT790和TMZ的组合协同产生了胶质瘤抗TMZ的活性（CI<1.0，图3）。这一结果证实，XCT790与TMZ的协同用药方案对治疗TMZ耐药的胶质瘤具有较大潜力。

2.4 ERRα调控TMZ耐药胶质瘤细胞WNT通路相关基因表达

为了探究ERRα对胶质瘤TMZ耐药调控的机制，我们利用PCR对给予XCT790（2 mmol/L）和敲减ERRα后U87 TMZ耐药细胞株Wnt5a、GSK3β、Axin、APC、β-catenin基因表达进行检测，结果表明，给予XCT790和敲减ERRα均降低U87耐药细胞株Wnt通路相关基因的表达（图4）。

2.5 XCT790抑制TMZ耐药的胶质瘤异种移植小鼠瘤体生长

基于我们在体外研究中的发现，有理由认为XCT790在体内同样具有逆转胶质瘤对TMZ耐药性的作用。为了验证XCT790对TMZ耐药的胶质瘤的治疗作用，我们在裸鼠中建立了TMZ耐药胶质瘤细胞异种移植模型。12只模型动物等分为3组，空白对照组动物给予溶剂对照，TMZ治疗组每日腹腔注射100 mg/kg TMZ，联合治疗组在给予TMZ治疗的基础上额外给予20 mg/kg的XCT790。结果显示，与单用TMZ治疗组相比，XCT790+TMZ治疗组模型动物移植瘤生长速度和瘤体重量均显著降低（图5）。

3 讨论

本研究发现，敲减ERRα能有效逆转胶质瘤细胞TMZ耐药；接着又证实了ERRα反向激动剂XCT790联用TMZ在离体和在体实验中对TMZ耐药的胶质瘤细胞的治疗均体现出显著协同作用。进一步研究发现，敲减ERRα和XCT790联用逆转胶质瘤对TMZ耐药性的作用可能与抑制耐药细胞中Wnt5a信号通路密切相关。以上结果证实了抑制ERRα功能可逆转胶质瘤细胞对TMZ耐药性，这一作用可能与抑制Wnt5a信号通路的功能密切相关。

作为极具潜力的抗肿瘤药物靶点，近年来，关于ERRα的研究受到极大关注。ERRα全长423个氨基酸，其编码基因位于人染色体11q13位点，全长约20 kb，包括7个外显子和6个内含子。ERRα在体内广泛表达，从心肌、消化道、大脑、骨骼肌、棕色脂肪以及乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤等均能检出。ERRα以二聚体形式与雌激素反应元件结合来发挥其生物学效应，还能以单体形式与雌激素相关受体反应元件结合。ERRα对于代谢靶基因的精确调控在机体的能量代谢中起着重要的作用。ERRα在机体中参与的代谢过程主要有：糖代谢、脂代谢、线粒体氧化代谢、自适应能量代谢等。这些功能的发挥与组织器官的发育、细胞的衰老、肿瘤的发生和发展等密切相关。ERRα在多种肿瘤中过表达，如乳腺癌、卵巢癌、胶质瘤、前列腺癌、结直肠癌、宫颈癌、子宫内膜癌等，而且与肿瘤的迅速发展、预后不良密切相关[12-14]。

近年來，由Wnt5a所调控的Wnt信号通路在神经胶质瘤中的作用引起了广泛关注，为胶质瘤靶向治疗提供了新思路。Wnt信号转导通路常见于胚胎发育和某些正常生理过程，并参与了干细胞的多能性维持或分化，以及细胞增殖。迄今为止，已发现至少19个Wnt家族成员。其中， Wnt5a在肿瘤的发生发展中发挥多种功能，其在组织中可对细胞的迁移、侵袭及血管的生成产生影响，并且对组织的修复和维持组织的稳态起着极其重要的作用。Wnt5a既能作用于经典的Wnt/β-catenin通路，又能活化非经典的Wnt/Ca2+及Wnt/PCP通路。近期研究表明，Wnt5a在胶质瘤中高表达，并与恶性胶质瘤侵袭性、病情进展及预后不良显著相关[15-16]。Wnt5a通过结合Ryk受体，调控MMP-2表达促进胶质瘤侵袭与浸润[17]。Wnt5a还参与了胶质瘤上皮间质转化[18]。

总体而言，我们的研究明确了抑制ERRα功能可有效逆转胶质瘤对TMZ的耐药性，这一作用可能与抑制耐药胶质瘤细胞Wnt5a信号通路的功能密切相关。这一发现为胶质瘤耐受TMZ问题的解决提供了新的思路和见解。

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