振腹手法对抑郁症大鼠模型的干预机制研究

周可林 董 硕 国 生 魏培栋 付国兵 杨靖颐

(1 北京中医药大学,北京,100029; 2 北京中医药大学东方医院,北京,100078)

抑郁症以其高患病率、高复发率、高致残率、高自杀倾向的特点,成为全世界医学界亟待解决的问题,目前抗抑郁的治疗方法主要以抗抑郁药物治疗为主。中医认为抑郁症属于“郁病”的范畴,目前认为肝郁脾虚证是抑郁症最常见的中医证型[1-2]。有研究发现,肝郁脾虚的抑郁症模型大鼠骨骼肌中线粒体含量减少,且线粒体的形状结构也存在异常,因而导致骨骼肌线粒体的功能出现异常,并认为这可能与抑郁症的低动力症状相关[3]。前期研究发现振腹推拿可以明显改善抑郁症患者的症状评分,对于患者的情绪低落、精力减退等症状有明显的改善作用[4]。因此本研究拟通过慢性不可预见性温和应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)方法建立抑郁症大鼠模型,探究振腹推拿手法对于抑郁症模型大鼠骨骼肌组织炎症介质白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的含量,沉默信息调节因子1(SilenceInformation Regulator 1,SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物-1α(Peroxisome Proliferator-activated Receptor Gamma Coactivator-1α,PCG-1α)、核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)的蛋白及信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)含量的调节作用,分析振腹推拿改善抑郁症骨骼肌组织炎症损伤的干预作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级SD大鼠32只,10周龄,体质量(330±20)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012-0001。所有大鼠在北京中医药大学动物房(SPF级)中饲养,室温(21±2)℃,相对湿度30%～40%,光照保持正常昼夜节律,并且饲养环境保持安静。实验全过程在北京中医药大学动物伦理委员会的监督下完成(伦理审批号:BUCM-4-201911260 2-4049)。

1.1.2 药物 盐酸氟西汀胶囊(礼来苏州制药有限公司,国药准字:J20170022)。

1.1.3 试剂与仪器 蛋白提取液(货号:MDL91201)、蛋白酶抑制剂(货号:MD912893)、二抗(货号:MD932477),均购自北京Medical Discovery Leader公司;核因子κB一抗(货号:AF5006)、SIRT1一抗(货号:DF6033)、PCG-1α一抗(货号:AF5395),均购自江苏亲科生科研究中心有限公司;IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉Elabscience公司,货号:E-EL-R0012 c);IL-8酶联免疫吸附测定试剂盒(上海Thermo Fisher公司,货号:KAC1301);IL-4酶联免疫吸附测定试剂盒(货号:SEA077Ra)、IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒(货号:SEA079Ra)、IL-10酶联免疫吸附测定试剂盒(货号:SEA056Ra)、TNF-α化学发光免疫分析测定试剂盒(货号:SCA133Ra),均购自武汉cloud-clone corp公司。

分光光度仪(Mettler Toledo,瑞士,型号:UV5);电泳仪(北京百晶生物技术有限公司,型号:BG-subMIDI);离心机(Eppendorf公司,德国,型号:Centrifuge5415D);凝胶成像仪(Bio-rad,美国,型号:GelDoc Go);实时荧光定量PCR仪(Applied biosystems,美国,型号:QuantStudio 3);全波长扫描酶标仪(Thermo Scientific,美国,型号:Multiskan GO51119200)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 适应性饲养1周后,从32只大鼠随机选取8只作为正常组,正常饲养,不进行任何干预,其余3组大鼠采用CUMS方法建立抑郁症大鼠模型。造模刺激包括束缚3 h、45 ℃热烘5 min、孤笼饲养24 h、陌生物体刺激24 h、85 dB白噪声5 h、45°笼具倾斜24 h、夹尾1 min、禁食禁水24 h等。按照随机数字表法分配,使大鼠不能预料刺激的发生,造模共持续7周[5]。在造模第3周末将造模的24只大鼠随机分为模型组、振腹组、氟西汀组,每组8只。

1.2.2 干预方法 造模完成后开始进行手法和药物干预,正常组不进行CUMS造模刺激,按照1 mL/100 g给予去离子水灌胃,1次/d,共计4周;模型组进行CUMS造模刺激,以1 mL/100 g去离子水灌胃,1次/d,共4周;振腹组进行CUMS造模刺激,进行振腹推拿手法干预,1次/d,共4周;氟西汀组进行CUMS造模刺激,同时给予氟西汀悬浊液灌胃,根据成人服用20 mg/d氟西汀换算,给药量为2.083 mg/100 g体质量,灌胃总量为11 mL/100 g,1次/d,共4周。振腹推拿操作方法:以神阙穴为中心,行三指振腹手法15 min,频率300次/min(神阙穴定位:参考《实验针灸学》《实验推拿学》及相关文献,以剑突至耻骨联合上缘上2/3与下1/3交界处为穴)。

1.2.3 标本采集 于第7周末完成干预和行为学实验结束后处死大鼠并进行组织取材。处死方法:给予3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后断头处死,剥离双下肢腓肠肌-80 ℃保存备用。分别检测炎症介质IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α的含量,SIRT1、PCG-1α、核因子κB蛋白及mRNA的含量。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 宏观表征 每天观察各组大鼠的精神状态、皮毛的光泽度、给予不同刺激时产生的反应剧烈程度以及便质等情况,观察各组大鼠中这些表现是否随着造模时间的推移发生了明显的变化。

1.3.2 糖水偏好实验 在造模及干预结束后,先对大鼠进行糖水训练,共3 d。第1天给予每只大鼠2瓶糖水,训练持续时间为24 h,第2天将其中1瓶糖水换成去离子水,训练时间同样为24 h。2次糖水训练结束之后,第3天给予每组大鼠禁食禁水24 h处理,之后正式进行糖水偏好实验。准备与大鼠数量相等的糖水瓶和去离子水瓶,并相应装入一定量的糖水和去离子水,然后对糖水瓶和去离子水瓶进行称重和编号,将每只大鼠单独放入1个小笼,然后每只大鼠分别给予1瓶糖水和1瓶去离子水,1 h后将糖水瓶和去离子水瓶取下,称量剩余量,计算出实验前后糖水瓶和去离子水瓶的重量变化。糖水消耗率=糖水消耗量/(糖水消耗量+去离子水消耗量)×100%。

1.3.3 强迫游泳实验 强迫游泳实验分为2步进行,首先在实验前1 d将每只大鼠单独放入1个透明玻璃圆筒中(直径40 cm,高50 cm),其中倒入(22±1)℃常温纯水,水深20 cm,使其游泳15 min作为正式实验前的训练。训练完成24 h后进行正式实验,保持实验环境安静,测试时将大鼠头部正面朝壁缓慢放入塑料桶内使其自由游泳6 min,以大鼠放弃挣扎、露出口鼻、保持漂浮所需的最小运动外肢体的停止运动作为不动标准,用秒表记录大鼠停止挣扎不动或无任何活动的时间,每只大鼠强迫游泳6 min,其中包括适应性游泳1 min,记录后5 min内大鼠的累计不动时间(s),并且在每只大鼠游泳之后进行换水,以免对下1只大鼠行为有影响。通过该试验模拟抑郁症核心症状之一的“行为绝望”。

1.3.4 旷场实验 在操作间的正中放置旷场箱,旷场箱高40 cm,底边长50 cm,底面平均分为25个小方格,中央9个小格为中央区。根据旷场箱正中格的位置,在其正上方安置摄像头并连接电脑录像,使整个旷场区域能够清晰地出现在视野中,并对操作间进行避光处理,实验期间保持安静。先将大鼠放置于操作间的黑暗环境中适应5～10 min。开始实验时将大鼠从笼子中拿出放在旷场箱的正中格内,同时计时并开始录像,观察并记录5 min内大鼠活动情况。5 min后取出大鼠,先用卫生纸把大鼠遗留的尿液和粪便擦拭干净,最后用毛巾蘸低浓度乙醇彻底擦拭箱底,消除上1只大鼠遗留气味后,将下1只大鼠按照以上步骤处理。运用Etho Vision 3.0行为学分析软件对各组大鼠的运动情况进行分析,所统计观察的内容包括总运动距离、中央区进入次数、中央停留时间以及穿格次数。

1.3.5 酶联免疫吸附试验法检测炎症介质含量 取适量组织块,制备细胞裂解液,4 ℃条件下1 000×g,离心20 min,分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。依次加入不同浓度的标准品及稀释液,余孔加待测样品100 μL,37 ℃温育1 h。每孔加检测溶液A工作液100 μL,37 ℃温育1 h。弃去孔内液体,每孔用350 μL的洗涤液洗涤,浸泡1～2 min,重复洗板3次。每孔加检测溶液B工作液100 μL,37 ℃温育30 min。每孔加TMB底物溶液90 μL,37 ℃避光显色。加终止溶液终止反应。450 nm波长测量各孔的光密度值(Optical Density,OD)。

1.3.6 蛋白质印迹法检测蛋白表达 取组织裂解提取蛋白,BCA试剂盒测定蛋白含量;取30 μL蛋白电泳分离,转至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜,脱脂奶粉封闭1 h;加入对应一抗,4 ℃孵育过夜;加入二抗孵育1 h,TBST缓冲液清洗;电致化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)显影,以β-机动蛋白为内参计算蛋白相对表达。

1.3.7 实时荧光定量PCR检测mRNA表达 实时荧光定量PCR提取总RNA,反转录为cDNA,以β-机动蛋白为内参,反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性10 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40个循环。引物设计合成见表1。

表1 检测mRNA的引物设计合成

2 结果

2.1 模型评价

2.1.1 宏观表现 造模开始前,所有大鼠均表现活跃、动作灵敏、精神状况良好、毛发光泽整齐,大便形态正常,干湿适中。随着每日造模的持续进行,与正常组大鼠比较,造模刺激后的大鼠对外界应激的反应度逐渐下降,对寒冷等外界刺激的抵抗能力下降,对外界环境的改变和给予的刺激反应迟钝,活跃程度明显降低,精神萎靡,毛发杂乱色泽暗淡无光泽,宏观表现与正常组大鼠比较出现明显差异,并且粪便外观不成形;造模3周后开始对振腹组与氟西汀组大鼠进行干预直至第7周结束,经过干预后的大鼠活跃程度逐渐恢复,与模型组比较,在日常造模过程中对外界刺激的抵抗程度显著增强,抵抗寒冷等外界刺激的抵抗力增强,并且振腹组大鼠的粪便质地改善明显。

2.1.2 糖水偏好实验 第0周(即应激前)末,各组大鼠的糖水偏好率差异均无统计学意义(均P>0.05);第3周(即应激3周)末,与正常组比较,模型组、振腹组和氟西汀组大鼠的糖水偏好率显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.01),模型组、振腹组和氟西汀组3组糖水偏好率组间比较差异均无统计学意义(均P>0.05),经过3周的CUMS造模刺激,模型组、振腹组和氟西汀组3组均已造模成功,且3组造模程度相似;第7周(即干预4周)末,与正常组比较,模型组大鼠的糖水偏好率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),与模型组比较,振腹组、氟西汀组大鼠的糖水偏好率显著升高,差异有统计学意义(均P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠糖水偏好率比较

2.1.3 强迫游泳实验 第0周(即应激前)末,各组大鼠的绝望时间差异均无统计学意义(均P>0.05);第3周(即应激3周)末,与正常组比较,模型组、振腹组和氟西汀组大鼠的绝望时间均显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),模型组、振腹组和氟西汀组3组之间的绝望时间比较差异均无统计学意义(均P>0.05),经过3周的CUMS造模刺激,模型组、振腹组和氟西汀组3组均已造模成功,且3组造模程度相似;第7周(即干预4周)末,与正常组比较,模型组大鼠的绝望时间显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),与模型组比较,振腹组、氟西汀组大鼠的绝望时间显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠绝望时间比较

2.1.4 旷场实验 经过7周的造模刺激,与正常组比较,模型组大鼠的总移动距离、中央进入次数、中央停留时间和穿格次数差异均有统计学意义(均P<0.01);经过4周的干预,与模型组比较,振腹组、氟西汀组大鼠的总移动距离、穿格次数显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);与模型组比较,氟西汀组的中央进入次数、中央停留时间差异均有统计学意义(均P<0.01),振腹组的中央进入次数、中央停留时间与模型组比较有上升趋势。见表4,图1。

图1 各组大鼠旷场行为学检测

表4 各组大鼠旷场实验结果比较

2.2 各组大鼠炎症介质含量的比较 经过7周的造模刺激,与正常组比较,模型组大鼠IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.01),IL-4、IL-10含量降低,差异均有统计学意义(均P<0.01);经过4周的干预,与模型组比较,振腹组、氟西汀组大鼠IL-4、IL-10含量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.01),IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表5。

表5 各组大鼠炎症介质含量比较

2.3 各组大鼠核因子κB、SIRT1、PGC-1α含量的比较 经过7周的造模刺激,与正常组比较,模型组大鼠的SIRT1蛋白含量、SIRT1mRNA含量显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.01);经过4周的干预,与模型组比较,振腹组大鼠的SIRT1蛋白含量、SIRT1mRNA含量显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.01),氟西汀组大鼠的SIRT1蛋白含量、SIRT1mRNA含量均显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。见图2。

图2 各组大鼠SIRT1蛋白和SIRT1mRNA水平注:与模型组比较,**P<0.01

经过7周的造模刺激,与正常组比较,模型组大鼠的PGC-1α蛋白含量、PGC-1αmRNA含量均显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.01);经过4周的干预,与模型组比较,振腹组大鼠的PGC-1α蛋白含量升高,差异有统计学意义(P<0.05),振腹组的PGC-1α mRNA含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),氟西汀组大鼠的PGC-1α蛋白含量、PGC-1αmRNA含量均显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.01)。见图3。

图3 各组大鼠PCG-1α蛋白和PCG-1αmRNA水平注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01

经过7周的造模刺激,与正常组比较,模型组大鼠核因子κB的蛋白含量、mRNA含量均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);经过4周的干预,与模型组比较,振腹组大鼠核因子κB的蛋白含量下降,差异有统计学意义(P<0.05),振腹组的核因子κB mRNA含量显著下降,差异有统计学意义(P<0.01),氟西汀组大鼠核因子κB的蛋白含量、核因子κBmRNA含量均显著下降,差异均有统计学意义(均P<0.01)。见图4。

图4 各组大鼠核因子κB蛋白含量和核因子κB mRNA水平注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

抑郁症是一种由于神经调节系统失调导致的疾病,目前研究发现其发病与中枢系统和外周系统的炎症反应密切相关[6]。临床研究发现,抑郁症患者外周组织和中枢脑组织中炎症介质水平升高[7];还有研究发现炎症介质可以直接诱导人类和啮齿动物产生抑郁行为[8-10],这些都证明了外周组织的炎症反应是抑郁症发病的重要环节。

研究发现增加骨骼肌组织中PGC-1α的含量,可以抑制IL-6、TNF-α等炎症介质的表达[11];相反,如果特异性敲除大鼠的骨骼肌PGC-1α,可以导致大鼠骨骼肌组织中IL-6和TNF-α等炎症介质的表达增加。此外,还有研究发现,小鼠经历5周的慢性应激后,骨骼肌特异性PGC-1α转基因小鼠的抑郁程度明显低于野生型小鼠,并且转基因小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症介质的mRNA含量降低,IL-10、IL-4等抑炎因子的mRNA含量升高。上述研究证明外周系统骨骼肌组织中的PCG-1α不仅可以改善骨骼肌组织的炎症损伤,还可以调节中枢系统海马组织中的炎症反应,因此骨骼肌组织中PCG-1α的含量变化是抑郁症发生发展的关键因素[12]。此外,有研究表明PCG-1α的这一作用效应可能与PGC-1α抑制p65的磷酸化,进而抑制了p65对核因子κB基因的激活作用有关[13]。因此,研究认为PGC-1α作为核因子κB的上游因子可以抑制核因子κB介导的信号通路的表达,从而减少外周和中枢系统中炎症介质的表达和释放,有利于缓解中枢系统的炎症反应[14]。SIRT1可使PGC-1α、核因子κB等核转录因子去乙酰化,在调节线粒体损伤和炎症损伤等方面具有重要作用[15]。研究发现,SIRT1基因敲除后的小鼠产生了海马基因表达变化、突触可塑性缺失和树突分支减少等表现[16],这可能与SIRT1介导的PGC-1α信号通路表达有关[17-19]。

本研究发现,经过4周的振腹推拿手法治疗可以明显改善CUMS诱导的抑郁症模型大鼠对外界刺激的反应、粪便质地以及糖水偏好率、绝望时间和旷场试验的总移动距离、穿格次数,说明振腹推拿可以改善抑郁症模型大鼠的糖水偏好、行为绝望和自主探索能力,改善抑郁症状,与之前的研究结果相同;前期研究发现,振腹推拿手法干预可以改善抑郁症模型大鼠的骨骼肌线粒体能量代谢异常的情况,缓解抑郁症大鼠的低动力症状[20]。在此基础上本研究发现,振腹推拿手法可以抑制骨骼肌组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症介质的表达,增加IL-4、IL-10等抑炎因子的含量,从而改善抑郁症外周组织的炎症反应;进一步发现振腹推拿是通过抑制核因子κB的蛋白表达,促进SIRT1、PGC-1α的蛋白表达,从而改善抑郁症模型大鼠骨骼肌炎症损伤的,并进一步推测振腹推拿手法可能是通过抑制骨骼肌炎症损伤从而实现改善抑郁症大鼠骨骼肌线粒体能量代谢的手法作用。

抑郁症属于中医“郁病”范畴,中医认为其发病机制与思虑过度导致的肝失疏泄、脾失健运、心失所养、脏腑气血阴阳亏虚密切相关,这与现代研究认为抑郁症病因是抑郁症患者较为敏感、心思细腻、多思的观点相符合[21-22]。振腹推拿以腹部为主要操作部位,腹部为十二经脉汇聚之处,奇经八脉中的任、督、冲3脉也皆起于腹部胞中,人体的主要经脉均与腹部有着密切的关系。《圣济总录》记载:“五脏六腑之精华,皆见于目,上注于头。”《普济方》记载:“盖头者诸阳所会,脑者物所受命。”说明五脏六腑的精华上输于脑,脑正常的功能依赖于这些精华物质,而行于腹部的经脉就是精华运输至脑的主要通道。《灵枢》中指出“胃气上注于肺……上走空窍……入络脑”,《重订通俗伤寒论》记载“胃之支脉,上络心脑……故昏不识人”,李东垣认为“足阳明之别络于脑”,通过众多医家的观点可以发现,在腹部循行的众多经脉中以足阳明胃经、足太阴脾经尤为重要,胃的受纳、腐熟水谷的功能与脾的升清、运化功能相配合,升降相济的气机运行既能够将精微物质上输至头,又能使头部的浊气下降,可以带动全身的气机运行,从而运送精华、传导糟粕,对脑神的调节至关重要。振腹推拿利用作用于腹部的振动刺激腹部经络,增强腹部经脉的调节功能,调畅气机,升清降浊,从而调治脑系疾病。

综上所述,振腹推拿手法可以改善抑郁症模型大鼠的症状,增强其自主探索能力,减少其绝望时间,而这一手法效应可能是通过调节骨骼肌组织SIRT1/PCG-1α/NF-κB信号通路,降低IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症介质的含量,增加IL-4、IL-10等抑炎因子的含量,缓解外周组织的炎症损伤实现的。

利益冲突声明:无。