烟草黑胫病菌高效杀菌剂的筛选

李彩斌，程云龙，何 轶，彭 宇，李章海，黄衍章，陈方新*

1. 贵州省烟草公司毕节市公司，贵州省毕节市七星关区贵毕路519 号 551700

2. 作物有害生物综合治理安徽省重点实验室 安徽农业大学植物保护学院，合肥市长江西路130 号 230036

3. 中国科学技术大学烟草与健康研究中心，合肥市徽州大道1129 号 230052

烟草黑胫病是危害烟草的主要病害之一。引起烟草黑胫病的病原菌为寄生疫霉烟草变种（Phytophthora parasiticavar.nicotiana），该病菌侵染烟株根部和茎基部后，可迅速蔓延至维管束，破坏维管束的结构和功能，造成烟株枯萎，影响烟叶的产量和品质［1-3］。烟草黑胫病在烟草各生育期均可发生，但在成株期尤为严重，可造成烟叶绝收，给烟农带来巨大的经济损失。该病害分布范围广泛，温带、热带和亚热带烟区均有发生。我国除黑龙江省外，其他省份植烟区均有黑胫病发生，其中贵州、云南、安徽、河南和山东等省发生较为普遍［4-8］。

烟草黑胫病的防治措施主要有抗病品种的利用、农业防治、生物防治和化学防治等［9］。目前，施用化学杀菌剂仍然是防治烟草黑胫病的主要手段，生产上使用的常规杀菌剂有甲霜灵、烯酰吗啉和氟吗啉等。唐旭兵等［10］采用抑菌圈试验法比较了7种常用杀菌剂对烟草黑胫病菌的抑制作用，结果表明25%烯酰吗啉对烟草黑胫病菌具有明显的抑制作用；蒲小明等［11］分析了氟吡菌胺等6种杀菌剂对烟草黑胫病菌的室内毒力，结果发现氟吡菌胺的毒力最高，其次是烯酰吗啉。然而长期、大量、高频次使用某一种单一药剂易使病菌产生抗药性，降低防效［12-15］，故需不断筛选新的替代防治药剂。因此，采用菌丝生长速率法分析了22种杀菌剂对烟草黑胫病菌的抑制作用，测定了抑菌效果明显的7种杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的EC50值，并以烯酰吗啉和甲霜灵为对照药剂，通过盆栽试验分析了双炔酰菌胺对烟草黑胫病的防治效果，旨在为筛选防治烟草黑胫病的高效杀菌剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与烟草品种

烟草黑胫病菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）分离自贵州省毕节市金沙县烟草病株。供试烟草品种为云烟87，在育苗盘中培育至5 片真叶后备用。

1.2 供试培养基

燕麦琼脂培养基（OA 培养基）。称取30 g 燕麦加入1 000 mL 的纯水中煮沸4~5 min，用4 层纱布过滤，弃残渣，留滤液，在滤液中加15 g琼脂粉，待琼脂粉完全溶解后，加纯水定容至1 000 mL，分装后高压蒸汽灭菌备用。

1.3 供试杀菌剂

20%丁吡吗啉悬浮剂（江苏耘农化工有限公司）、23.4%双炔酰菌胺悬浮剂（先正达南通作物保护有限公司）、50%烯酰吗啉悬浮剂（巴斯夫植物保护江苏有限公司）、20%氟吗啉可湿性粉剂（沈阳科创化学品有限公司）、70%代森锰锌可湿性粉剂（四川润尔科技有限公司）、1%申嗪霉素悬浮剂（上海农乐生物制品股份有限公司）、25%甲霜灵可湿性粉剂（鹤壁市禾盛生物科技有限公司）、20%辛菌胺醋酸盐水剂（潍坊万胜生物农药有限公司）、66.5%霜霉威盐酸盐水剂（江苏盛丰生物化工有限公司）、70%丙森锌可湿性粉剂（拜尔股份有限公司）、25%吡唑醚菌酯悬浮剂（连云港立本作物科技有限公司）、65%代森锌可湿性粉剂（江苏利民化工股份有限公司）、80%三乙膦酸铝可湿性粉剂（江苏利民化工股份有限公司）、70%噁霉灵可湿性粉剂（青岛鑫润生物科技有限公司）、40%菌核净可湿性粉剂（江苏禾盛化工股份有限公司）、50%氯溴异氰尿酸可湿性粉剂（河南银田精细化工有限公司）、40%氟硅唑乳油（河北冠龙农化有限公司）、70%敌磺钠可溶性粉剂（山东天威农药有限公司）、50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂（江苏辉丰生物农药股份有限公司）、30%噁唑菌酮水分散粒剂（北京华戎生物激素厂）、50%异菌脲悬浮剂（苏州富美实植物保护剂有限公司）、20%腐霉利悬浮剂（江西禾益化工股份有限公司）。以上药剂有效成分含量均为质量分数。

1.4 试验方法

1.4.1 供试杀菌剂的初筛

参照文献［16］中的方法，将烟草黑胫病菌转接到OA 培养基平板上活化，5 d 后从菌落边缘制备菌碟（直径5.0 mm）备用。将供试的22 种杀菌剂配制成5.0、1.0 和0.5 mg/L 3 个浓度梯度的含药OA 培养基平板，将菌碟分别接入含不同浓度不同杀菌剂的OA 平板上，置于28 ℃的培养箱中培养3 d 后，采用十字交叉法［17］测量菌落直径。通过菌丝生长抑制率筛选抑菌效果好的供试杀菌剂。

菌落直径=测量菌落平均直径-5.0 mm

菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.4.2 有效杀菌剂的室内毒力测定

根据推荐使用剂量将初筛抑菌效果好的杀菌剂配制成母液。母液按10n进行系列稀释后充分摇匀，配制成5 个浓度梯度。待OA 培养基冷却至45~50 ℃，将其倒入直径9 cm灭菌后的培养皿中制成含药OA 培养基平板，每个浓度设置4 次重复，并设置空白对照。用接种针将预先制备的菌碟接入含药OA 培养基平板上，置于28 ℃培养箱中培养3 d 后，采用十字交叉法测量菌落直径。通过菌丝生长抑制率值和各有效药剂浓度对数值之间的线性回归关系，计算各供试杀菌剂对烟草黑胫病菌的EC50值。

1.4.3 双炔酰菌胺对烟草黑胫病的室内盆栽防效

室内盆栽防效试验于2020年8月在安徽农业大学植物保护学院温室进行。选取生长一致的健康烟株，通过烟株茎基部浇淋的方式施药。施药3 d 后，将烟草黑胫病菌游动孢子悬浮液按50 mL/株接种至烟苗茎基部，并用脱脂棉保湿48 h。游动孢子悬浮液接种浓度为106cfu/mL。接种后的烟苗放置于28 ℃温室中培养30 d 后调查发病株数和严重度。试验设置4个处理，分别为：（1）23.4%双炔酰菌胺悬浮剂8.5 a.i. mg/株；（2）50%烯酰吗啉可湿性粉剂18.2 a.i. mg/株；（3）25%甲霜灵可湿性粉剂22.7 a.i.mg/株；（4）清水对照。其中处理（2）和处理（3）为对照药剂。每个处理设3 次重复，每个重复20 株烟苗。按1 100株/667 m2确定处理用药量。

根据GB/T 23222—2008［18］进行烟草黑胫病严重度分级。病株率、病情指数和病指防效计算公式如下：

1.5 数据处理

试验数据采用DPS 7.05和Excel 2010统计软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 烟草黑胫病菌有效杀菌剂的筛选

测定22种供试杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制效果，发现在供试杀菌剂中，丁吡吗啉、双炔酰菌胺、烯酰吗啉、甲霜灵、氟吗啉、代森锰锌和申嗪霉素7 种杀菌剂（5 mg/L）对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制效果较好。由表1可见，在含药浓度为5 mg/L的OA培养基上，上述7种杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制率均超过70%，其中双炔酰菌胺和丁吡吗啉浓度为5 mg/L时对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制率均为100%。烯酰吗啉、甲霜灵、氟吗啉、代森锰锌和申嗪霉素5种杀菌剂浓度为5 mg/L时对烟草黑胫病菌菌丝生长抑制率分别为89.45%、88.62%、82.25%、76.82%和74.46%。其他15种供试杀菌剂浓度为5 mg/L时对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制率均低于50%。

表1 供试22种杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制效果Tab.1 Inhibitory effects of 22 fungicides on mycelial growth of P. parasitica var. nicotianae

2.2 有效杀菌剂的室内毒力测定

根据初筛结果，进一步测定了丁吡吗啉、双炔酰菌胺、烯酰吗啉、甲霜灵、氟吗啉、代森锰锌和申嗪霉素等7 种杀菌剂对烟草黑胫病菌的毒力。由表2 可见，7种杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长均具有较好的抑制作用。EC50值从大到小依次为：氟吗啉＞申嗪霉素＞甲霜灵＞代森锰锌＞丁吡吗啉＞烯酰吗啉＞双炔酰菌胺。其中双炔酰菌胺对黑胫病菌菌丝生长的EC50值（0.018 0 mg/L）最小，抑制效果最好；其次是烯酰吗啉，EC50值为0.783 0 mg/L，而氟吗啉对烟草黑胫病菌的EC50值最高，为2.023 0 mg/L。

表2 7种杀菌剂对烟草黑胫病菌的毒力测定Tab.2 Toxicity of 7 fungicides to P. parasitica var. nicotianae

2.3 双炔酰菌胺对烟草黑胫病的室内盆栽防效

由表3可见，未经杀菌剂处理的空白对照烟株黑胫病发病率为71.67%，病情指数为31.67。双炔酰菌胺、烯酰吗啉和甲霜灵浇淋处理的烟株黑胫病发病率和病情指数均显著低于空白对照。双炔酰菌胺对烟草黑胫病的室内盆栽防效显著高于对照杀菌剂烯酰吗啉和甲霜灵，其病指防效为80.11%。对照药剂烯酰吗啉和甲霜灵对烟草黑胫病的室内盆栽防效差异不显著，防效分别为64.89%和66.05%。

表3 双炔酰菌胺对烟草黑胫病的盆栽防效Tab.3 Control effects of mandipropamid on tobacco black shank in pot experiments

3 讨论

通过菌丝生长速率法测定了22种杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制效果，发现双炔酰菌胺、丁吡吗啉、烯酰吗啉、代森锰锌、甲霜灵、氟吗啉和申嗪霉素7种杀菌剂对烟草黑胫病菌具有明显的抑制作用，其中申嗪霉素对烟草黑胫病菌的毒力与俞芳菲等［19］报道的结果存在一定差异，推测原因可能与供试烟草黑胫病菌采自不同地区，对供试药剂的敏感性存在差异有关；烯酰吗啉对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制作用与郭敬等［20］的研究结果大致相同。本研究中发现双炔酰菌胺对烟草黑胫病菌菌丝生长具有强烈的抑制作用，且效果优于丁吡吗啉、烯酰吗啉、代森锰锌、甲霜灵、氟吗啉和申嗪霉素等化学杀菌剂。虽然双炔酰菌胺还未被登记用于烟草黑胫病的防治，鲜见用其防治烟草黑胫病的报道，但本研究中双炔酰菌胺对烟草黑胫病菌的 EC50值（0.018 0 mg/L）与韩秀英等［21］报道的山东省4地115株辣椒疫霉对双炔酰菌胺敏感程度（EC50平均值为0.012 mg/L）的研究结果基本一致。此外，盆栽防效试验结果显示，23.4%双炔酰菌胺悬浮剂可有效控制烟草黑胫病的危害，相对防效达80.11%，明显高于对照药剂50%烯酰吗啉悬浮剂和25%甲霜灵可湿性粉剂，这与宋晓兵等［22］在荔枝霜疫霉病和路粉等［23］在黄瓜霜霉病上的研究结果基本一致。可见，在烟草黑胫病菌对烯酰吗啉、甲霜灵等化学杀菌剂抗药性逐年加重的情况下［24-27］，双炔酰菌胺对烟草黑胫病的防治有一定潜力。

4 结论

22 种供试杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长均有一定的抑制作用，其中，氟吗啉、申嗪霉素、甲霜灵、代森锰锌、丁吡吗啉、烯酰吗啉和双炔酰菌胺7种杀菌剂对烟草黑胫病菌菌丝生长的抑制作用明显，EC50值分别为2.023 0、1.923 0、1.808 2、1.758 0、1.400 0、0.783 0和0.018 0 mg/L。23.4%双炔酰菌胺悬浮剂对烟草黑胫病的病指防效（80.11%）显著高于对照药剂50%烯酰吗啉悬浮剂（64.89%）和25%甲霜灵可湿性粉剂（66.05%），双炔酰菌胺可有效控制烟草黑胫病的危害。