NtLTP2 基因在烟草根系发育中的功能分析

段史江，陈小龙，梁周虹，王占伟，程小强，苏鹏飞，李亚纯，谢天琪，韩助君，杨永锋*

1. 江西省烟草公司吉安市公司，江西省吉安市青原区青原大道456 号 343009

2. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州市经济技术开发区第三大街8 号 450016

3. 江西中烟工业有限责任公司，南昌市高新开发区金圣工业科技园 330096

植物脂质转移蛋白（Lipid transfer protein，LTPs）是一类可溶性小分子蛋白质，分子量仅为6.5~10.5 kD。不同物种间LTPs 的氨基酸序列同源性仅为30%~70%，但这些LTPs均具有保守的信号肽结构CXn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C［1-3］。植物LTPs的三级结构可形成1 个包含4 个或5 个α-螺旋的脂质疏水腔，方便结合或转移糖脂、磷脂和脂肪酸等疏水物质［4-6］。

植物LTPs广泛参与植物的生长发育［7-9］、病原菌免疫反应［10-12］和各种非生物胁迫应答［13-15］。例如，烟树LTPs可参与介质层的合成，减少表皮水分的散失［8］；在烟草中过表达小麦Ltp 3F1基因可增强植株的抗真菌能力［10］；小麦LTP4能够被SA、ethylene、MeJA 和ABA 等激素诱导表达，参与多种环境胁迫的应答反应［16］；玉米中过表达ZmLTP3基因可以抑制体内ROS 积累，进而增强植株的抗盐胁迫能力［17］。李鹏等［18］通过生物信息学分析技术从烟草（K326）中鉴定出74个LTPs家族基因，基因表达模式分析发现大多NtLTPs基因能够被多种激素处理和非生物胁迫诱导表达。Choi等［19］从烟草表皮毛cDNA文库中克隆得到4 个NtLTPs基因，通过半定量技术进行组织表达分析，发现NtLTP1、NtLTP3和NtLTP4在地上组织中特异表达，在根部无表达；而NtLTP2在根部表达量最高，叶和茎部仅微量表达；进一步的基因功能研究发现，NtLTP1在长柄腺毛中特异表达，过表达NtLTP1可促进长柄腺毛的糖酯分泌，进而增强烟草的抗蚜虫能力。然而，关于根部优势表达基因NtLTP2的功能还未知。因此，对烟草NtLTP2的编码区和启动子序列进行克隆和生物信息学分析，并使用转基因技术分析NtLTP2编码区和启动子区域的生物学功能，旨在为了解该基因在烟草生长发育过程中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 烟草材料

试验材料为云烟87，培养于26 ℃、16 h光照/8 h黑暗光周期的植物培养室中。

1.2 基因克隆

1.2.1NtLTP2编码序列的克隆

按照Trizol 法分别提取五叶期云烟87 根、茎和叶的总RNA，反转录为cDNA，等比例（质量比）混合后用作基因克隆的模板。从NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下载普通烟草NtLTP2的cDNA 序列（AB518680），利用Premier 5.0 软件设计基因克隆引物（F：5'-CACTTCTCTTTTCTCTCTTCTCAA-3'，R：5'- AAGATTCTAACAGCTGGGAGTG- 3'）进 行PCR扩增。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 次循环；72 ℃延伸10 min。使用PCR产物纯化试剂盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］进行DNA 纯化，将纯化后的PCR产物连接至pMD19-T克隆载体，筛选阳性克隆送华大生物科技有限公司进行序列测定。

1.2.2NtLTP2启动子序列的克隆

以NtLTP2编码序列为探针，在烟草基因组数据库（http：//solgenomics.net/）中进行比对分析，获得普通烟草NtLTP2启动子序列。利用Premier 5.0 设计NtLTP2启动子序列的扩增引物（F：5'-TTGAACACT AAACTTGAAAATAC-3'，R：5'-GGGGCTGGTAGA GGGAGGT-3'）。以云烟87 叶片DNA 为模板进行PCR 扩增，PCR 反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，35次循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物纯化和测序方法同1.2.1节。

1.3 生物信息学分析

使 用 Protparam 软 件（http：//web.expasy.org/protparam/）预测蛋白质等电点和分子量。通过CD Search数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/）对蛋白质保守域进行预测。利用SWISSMODEL服务器（https：//swissmodel.expasy.org/）进行蛋白质三级结构预测。借助植物启动子分析数据库PLACE和Plant CARE进行顺式元件预测。

1.4 实时荧光定量PCR

1.4.1 基因组织表达分析

分别收集五叶期云烟87幼苗的根、茎、叶以及现蕾期的腋芽和花蕾，按照Trizol法分别提取各组织总RNA，反转录为cDNA。使用Premier 5.0 软件设计NtLTP2基因的实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物（F：5'-GCAAGATGAAGAAGG GTGGTAAT-3'，R：5'-TGGCTGTGGCGACGAGAT-3'）。以NtL25［20］作为内参基因（F：5'-GCTTTCTTC GTCCCATCAA-3'，R：5'-CCCCAAGTACCCTCGTA-3'），按照Light Cycler®480 SYBR Green I Master qPCR 试剂盒（瑞士Roche 公司）的操作说明配制反应体系，使用LightCycler®480 Ⅱ型荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司）进行qRT-PCR 反应。根据2-ΔΔCT法［21］计算各组织中NtLTP2基因的相对表达量。

1.4.2 转基因株系的基因表达量分析

培养未转化植株（对照，CK）和转基因株系至五叶期，分别提取根部总RNA。利用qRT-PCR 技术分析转基因株系中NtLTP2的相对表达量，方法同1.4.1节。

1.5 转基因株系的获得

1.5.1 ProLTP2：GUS载体的构建

在NtLTP2启动子的5'和3'端分别添加酶切位点Hind Ⅲ和BamHⅠ，设计 物（F： 5'-gagaagcttAAGCTTAAAACCGTCTCAATCATGTAAGT-3'，R：5'-cgg gatccGAATTCGTTAACAGAGTTTTGAGTTGCTG-3'）进行PCR 反应。通过双酶切反应将NtLTP2启动子连入pCAMBIA-NPT-GUS载体，获得NtLTP2启动子驱动GUS报告基因表达的载体（ProLTP2：GUS）。

1.5.2NtLTP2过表达载体的构建

在NtLTP2编码区的5'和3'端分别添加酶切位点BamH I 和EcoR I，设 计 引 物（F：5'- cgggatcc CACTTCTCTTTTCTCTCTTCTCAA-3'，R：5'-cggaa ttcAAGATTCTAACAGCTGGGAGTG-3'）进行PCR反应。通过双酶切反应将NtLTP2编码区连入pCXSN-FLAG 载体，获得NtLTP2的过表达载体（35S：NtLTP2）。

1.5.3 遗传转化和筛选

使用电击法将构建的载体导入农杆菌EHA105，通过农杆菌侵染法对烟草叶片进行遗传转化，转化后的叶片放置在含有30 mg/L Kan 的分化培养基上进行抗性筛选。提取过表达植株的叶片DNA，设计引物（5'-TTCATTTGGAGAGAACACGG-3'，R：5'-A AGATTCTAACAGCTGGGAGTG-3'），进行PCR 反应，鉴定阳性植株。通过连续自交获得阳性植株的T3代35S：NtLTP2株系。

取对照和ProLTP2：GUS 植株的根、茎和叶浸泡于GUS染色液［1 mmol/L EDTA的磷酸缓冲液（pH=7.0），2 mmol/L 亚铁氰化钾，2 mmol/L 铁氰化钾，100 mg/mL X-Gluc，0.1%（质量体积分数）Triton X-100］中，37 ℃过夜染色后置于70%（体积分数）乙醇中脱色，观察各组织的染色情况，对ProLTP2：GUS植株进行鉴定。

1.6 烟苗根系形态观察

取对照和各转基因株系种子各20粒置于1.5 mL离心管中，加入1 mL 10%（体积分数）次氯酸钠溶液消毒8 min，用无菌蒸馏水清洗5 次后播种于MS 固体培养基上。种子萌发7 d后，每个株系取3棵无菌苗，放置在含1.0%（质量体积分数）琼脂的MS 固体培养基上，垂直放置于光照培养箱中培养，14 d后统计幼苗的根长和侧根数。

1.7 根系参数分析

取对照和各转基因株系种子点播于装有营养土的漂浮盘中，培养至五叶期时对地上部和根系进行称重。使用Epson Perfection V700 Photo扫描仪（日本Epson 公司）进行根系图像扫描，通过WinRHIZO Pro2009a软件分析根系的总长、总表面积、总体积和平均直径。

1.8 数据处理和分析

使用SPSS 17.0软件进行数据处理与统计分析，并采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较处理间的显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 NtLTP2序列的克隆和生物信息学分析

烟草NtLTP2的编码区全长294 bp，编码97个氨基酸。预测NtLTP2 蛋白质分子量为10.11 kD，等电点为8.67，N 端信号肽包含25 个氨基酸（MKKGGNSFAAIILVVTLVLFLGEFL），第26 位的缬氨酸（Valine，V）为信号肽切割位点。保守域分析显示NtLTP2 具有1 个疏水腔（Hydrophobic cavity），同时具有nsLTP2 和AAI-LTSS 超家族的保守域（图1）。通过SWISS-MODEL分析NtLTP2的三级结构，发现其具有LTP蛋白质的典型结构，包含1个由4个α-螺旋组成的脂质疏水腔（图2）。

图1 NtLTP2保守结构域Fig.1 Conserve domain of NtLTP2

图2 NtLTP2三级结构Fig.2 3D-structure of NtLTP2 protein

植物LTPs 主要分为3 个亚族［22-24］。其中，LTPⅠ亚族的分子量约为9~10 kD，N 端包含1 个由21~27个氨基酸组成的信号肽；LTPⅡ亚族的分子量约为7 kD，N 端包含1 个由27~35 个氨基酸组成的信号肽；其余的LTP 蛋白质为LTP Ⅲ。LTPⅠ与LTPⅡ的疏水腔结构不同，LTPⅠ具有1个脂质疏水腔，而LTPⅡ成员具有2个疏水腔。因此，烟草NtLTP2应属于LTPⅠ亚族。

2.2 NtLTP2基因的组织表达分析

通过qRT-PCR 分析NtLTP2在烟草各组织的相对表达量，发现烟草NtLTP2在根部的表达量最高，约为其他组织的6~12 倍，NtLTP2在叶、茎、腋芽、花蕾和种子中仅微量表达（图3），推测NtLTP2为根部优势表达基因。

图3 烟草NtLTP2的组织表达分析Fig.3 Tissue expression analysis of NtLTP2 in tobacco

2.3 烟草NtLTP2 启动子的顺式元件预测和组织驱动特性分析

2.3.1NtLTP2启动子的顺式元件预测

克隆NtLTP2启动子序列2 610 bp，对其进行顺式元件预测，发现NtLTP2启动子序列存在大量分生组织表达元件以及激素和逆境响应元件。例如，分生组织表达元件CAT-box，ABA应答元件ABRE，MeJA应答元件CGTCA-motif，SA应答元件SARE，IAA响应元件TGA-element，厌氧诱导元件ARE，低温响应元件LTR-motif，以及逆境应答元件MYC-motif、MYB-motif 和TC-rich repeats 等（表1），推测NtLTP2可能参与植株生长发育和逆境胁迫应答过程。

表1 NtLTP2启动子顺式作用元件预测Tab.1 Cis-element prediction of NtLTP2 promoter

2.3.2NtLTP2启动子的组织驱动特性分析

使用ProNtLTP2：GUS 重组载体转化烟草，分析NtLTP2启动子的组织驱动特性。GUS 染色结果显示，ProNtLTP2：GUS植株可被染蓝色，且着色部位仅在植株的根部，叶和茎部未染蓝色（图4），说明NtLTP2启动子能够启动下游基因在烟草根部特异表达。下一步可以对NtLTP2启动子进行切割区段分析，寻找根部特异表达元件。

图4 叶片、茎和根的GUS染色Fig.4 GUS staining of leaves, stems and roots

2.4 烟草NtLTP2基因的功能分析

2.4.1NtLTP2过表达株系的鉴定

将35S：NtLTP2过表达载体转化烟草，通过PCR检测鉴定得到8 株阳性转基因株系（L1~L8）（图5）。通过qRT-PCR技术比较对照和8株转基因株系根部NtLTP2的相对表达量，发现8 株转基因株系中NtLTP2表达量均高于对照植株，约为对照的1.91~3.76 倍，其中L4、L6 和L7 的NtLTP2表达量最高，为对照的3.04~3.76倍。

图5 35S:NtLTP2株系的筛选和鉴定Fig.5 Screening and identification of 35S:NtLTP2 lines

2.4.2 过表达NtLTP2对根系发育的影响

将对照和3 个转基因株系（L4、L6 和L7）的种子消毒后点播于MS固体培养基上培养，期间跟踪观察种子的萌发和幼苗的生长过程，发现3个转基因株系的根系长势均优于对照，L4、L6 和L7 的侧根数均约为对照的2倍（图6），表明在烟草中过表达NtLTP2可促进侧根发育。

图6 MS固体培养基上CK和35S:NtLTP2转基因株系的根系形态比较Fig.6 Comparison of the root morphology between CK and 35S:NtLTP2 lines on MS medium

2.4.3 过表达NtLTP2对烟株生长发育的影响

跟踪观察对照和3 个转基因株系（L4、L6 和L7）的烟苗形态，发现3个转基因株系的烟苗长势均优于对照，L4、L6 和L7 的地上部分和根系重量均显著高于对照（表2、图7）。使用根系扫描仪分析对照和转基因株系的根部参数，发现L4、L6 和L7 根系的总长、总表面积和总体积均显著高于对照，而对照和转基因株系的根系平均直径无显著差异。以上结果表明在烟草中过表达NtLTP2可以促进根系发育，进而有助于烟苗地上部分的生长。NtLTP2调控烟草侧根发育的分子机制，以及NtLTP2在生物胁迫和非生物胁迫抗性中的功能有待进一步研究。

表2 CK和35S:NtLTP2株系的地上部分和根系参数比较①Tab.2 Comparison of the shoot and root system parameters between CK and 35S:NtLTP2 lines

图7 CK和35S:NtLTP2株系的烟苗长势和根系形态比较Fig.7 Comparison of the shoot and root morphology between CK and 35S:NtLTP2 lines

3 结论

通过基因测序和生物信息学技术对NtLTP2的编码区和启动子序列进行分析，结果表明NtLTP2属于LTPⅠ亚族成员，编码区全长294 bp，编码97 个氨基酸。NtLTP2启动子区域存在大量的分生组织表达元件以及激素和逆境响应元件，NtLTP2三级结构具有1个由4个α-螺旋组成的脂质疏水腔。组织表达分析结果表明烟草NtLTP2为根部优势表达基因，进一步通过GUS 报告基因研究NtLTP2启动子的组织驱动特性，发现NtLTP2启动子能够驱动下游基因在烟草根部特异表达。利用基因过表达技术研究NtLTP2的基因功能，发现该基因可正向调控烟草侧根发育，增加根系的表面积和体积，进而促进地上部分的生长发育。