枯草芽孢杆菌Czk1脂肽物质对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制效果研究

贺春萍， 樊兰艳， 吴贺， 梁艳琼， 吴伟怀， 李锐， 郑服丛

（1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海南省热带作物病虫害生物防治工程技术研究中心，海口 571101； 2.海南大学植物保护学院，海口 570228； 3.云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201）

天然橡胶是全球重要的战略物资，与煤炭、石油和钢铁并称四大工业原料，橡胶产业因遭受病害会造成1/4的总产量损失[1]。橡胶树白粉病和炭疽病（俗称“两病”）是影响橡胶干胶产量的主要病害，其为害橡胶树叶片、树梢和花序，造成胶树落叶、落花和落果，树梢干枯，以致推迟开割时间，使胶乳减产。目前，“两病”主要采用化学防治，但存在药剂种类少、防治方法单一、易引起抗药性等缺陷，且橡胶树属高大乔木，其用药量大、防治成本高和易造成生态环境污染等问题已经引起广泛关注。探究生物防治技术是环保、经济、安全的防控措施之一。

枯草芽孢杆菌能产生脂肽类、胞外蛋白、聚酮化合物、抗菌多肽等多种类型抗菌物质，这些抗菌物质在防治植物病害中起着重要作用[2]。其中非核糖体途径合成的脂肽类物质是其产生的主要抑菌活性物质之一，是生物农药和生物菌肥研发和利用的重要资源[3-4]，主要包括表面活性素（surfactins）、伊枯草菌素（iturins）和丰原素（fengycins）3大家族，不同家族的脂肽类化合物抑菌特性有所差异[5-6]。表面活性素能有效抑制病毒、支原体和细菌活性，对细菌的群集运动和生物膜形成起重要作用[7-9]，但对病原真菌没有显著抑菌活性[6,10]。伊枯草菌素具很强的抑真菌活性，但抑制细菌和病毒的能力有限[6,10]。丰原素则对丝状真菌具有很强的抑菌活性[7]。

目前，利用枯草芽孢杆菌防治植物病害已成为研究热点，但对橡胶树病害进行生防研究还停留在拮抗菌筛选、鉴定、生物学特性及抑菌物质分析等方面[11-13]。黄有航等[11]从橡胶树根际分离出的细菌菌株S43对橡胶树白粉病有较强拮抗作用，经鉴定为枯草芽孢杆菌，在橡胶树叶片上能较好定殖；时涛等[12]从橡胶树中分离出47份内生细菌，其中2株对橡胶树棒孢霉叶斑病病菌具有拮抗作用，经鉴定为枯草芽孢杆菌；孙亮等[14]研究发现，从植物根际分离的枯草芽孢杆菌HAB-1对橡胶树炭疽病菌和棒孢霉叶斑病病菌具有较强的抑菌活性，并观测了7种培养基质上HAB-1的抑菌形态及抑菌活性；赵璐璐等[15]发现，枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶树多种根病病原和炭疽病菌具有强拮抗作用，Czk1持续接种20代仍具有很强的抑菌活性。

本课题组从橡胶树根部分离获得枯草芽孢杆菌Czk1[16]，采用酸沉淀法从菌株发酵液中提取抑菌物质，通过Sephadex G25柱层析、MALDI-TOPMS分析和脂肽抗生素基因检测发现Czk1活性粗提物中含有Surfactin 、Fengycin和Iturin等脂肽抗生素[17-18]，其分泌的挥发性物质亦能有效抑制植物病原真菌的生长[19-20]。基于上述研究，通过对前期筛选出的对多种热带作物病害病原具有良好抑菌活性的B.subtilisCzk1不同质量浓度脂肽物质对橡胶树炭疽病菌的抑菌活性及“两病”抑制效果进行研究，旨在明确脂肽物质对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制效果，以期为橡胶树炭疽病和白粉病生物防控技术开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 生防枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Czk1、橡胶树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）RC178、橡胶树白粉病菌（Oidium heveae）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带特色经济作物病害研究组分离和保存。

1.1.2 供试橡胶品种 种植的橡胶种苗品种为‘热研7-33-97’。

1.1.3 供试培养基 LB种子培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂15 g，pH 7.2，121 ℃灭菌15 min。

发酵液培养基YPG：10 g·L-1酵母浸出粉，20 g·L-1胰蛋白胨，20 g·L-1葡萄糖，pH 7.0，121 ℃灭菌15 min。

1.1.4 供试试剂及药品 甲醇、氯仿、浓盐酸、吐温20等均为分析纯试剂；15%三唑酮可湿性粉剂购自江苏建农农药化工有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 Czk1脂肽类物质的提取 在LB平皿中活化Czk1，挑取单菌落接入LB液体种子培养基中，于28 ℃、180 r·min-1培养24 h，以7%(体积分数)接种量转接入100 mL发酵液培养基YPG中，28 ℃、180 r·min-1下振荡培养3 d。于4 ℃、10 000 r·min-1的条件下将发酵液离心10 min后收集上清液，然后用灭菌的0.22 μm 微孔滤膜过滤，获得无菌培养滤液。用6.0 mol·L-1盐酸调节无菌培养滤液pH至4.0，4 ℃冰箱过夜沉淀。然后于4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀物，将沉淀物冷冻干燥后用甲醇萃取2次，合并萃取液，在旋转蒸发仪中蒸发有机溶剂，真空冷冻干燥，得到脂肽类粗提物于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 Czk1脂肽类物质对橡胶树炭疽病菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定 脂肽类提取物溶于甲醇，并分别配制成40、60、80、100 mg·L-1系列质量浓度脂肽液[21]，采用杯碟法分别测定其抑菌活性。具体方法为：用无菌水从已产孢的橡胶树炭疽病菌平板上用灭菌涂布棒轻刮（冲洗）孢子，将孢子含量配制成1×108CFU·mL-1；然后用移液枪吸取100 μL孢子液均匀涂布于PDA平板，于平皿中心2.5 cm处呈对角线放置杯碟，向杯碟中分别加入100 μL的无菌水（CK）、甲醇和不同质量浓度的脂肽液。每处理3次重复，28 ℃倒置培养。待菌丝长出，测量各处理抑菌圈直径（mm），并观察抑菌圈周围菌丝的生长状况。

1.2.3 Czk1脂肽类物质对橡胶树炭疽病菌孢子萌发的抑制作用测定 将脂肽类提取物配制成0.1 mg·mL-1母液，分别稀释成10、20、40、60 mg·L-1的脂肽类提取液。用2%葡萄糖（质量体积分数）水溶液从平皿中洗下橡胶树炭疽病菌分生孢子，显微镜下调节每视野约100个分生孢子。吸取不同质量浓度脂肽类提取液各20 μL，涂布于玻片上，有机溶剂挥发后玻片表面形成药膜，再吸取20 μL橡胶树炭疽病菌孢子悬浮液于药膜上，以甲醇和清水（CK1）为对照。每处理3次重复，28 ℃培养。待对照组病菌孢子萌发率大于80%（10～12 h）时，记录孢子萌发数，并计算孢子萌发抑制率。孢子的芽管长度大于孢子的短半径视为萌发。

1.2.4 Czk1脂肽类抗菌物质对橡胶树炭疽病的防治评价方法 田间取橡胶树淡绿叶期的叶片，将其表面清洗干净，用针刺伤叶表面组织；按照1.2.2的方法制备1×108CFU·mL-1的RC178孢子悬浮液。设置6个处理：①喷施10 mg·L-1脂肽提取物后接种RC178；②喷施100 mg·L-1脂肽提取物后接种RC178；③喷施1 000 mg·L-1脂肽提取物后接种RC178；④喷施清水的对照（CK2）；⑤接种RC178；⑥喷施甲醇后接种RC178。每叶片在主脉两侧刺伤8个点，重复3次，用纱布保湿叶片并置于托盘中，28 ℃培养3～4 d，调查叶片发病情况，计算发病率，并用十字交叉法测量病斑大小。

以离体叶片接种试验中获得的最佳防效质量浓度脂肽提取物进行盆栽防效评价。按照1.2.2的方法制备1×108CFU·mL-1的RC178孢子悬浮液。选取长势一致健康的‘热研7-33-97’橡胶树盆栽幼苗，采用喷雾法在橡胶苗淡绿叶期分别喷施上述最佳防效的脂肽提取物、甲醇、清水，然后分别接种RC178，以不接种病原菌的清水为对照（CK3）。每个处理3株幼苗，每株选取9张叶片，每张叶片刺伤1～2个点。3～4 d后调查发病情况。

1.2.5 Czk1脂肽类抗菌物质对橡胶树白粉病防治效果的评价 选取长势一致健康的‘热研7-33-97’橡胶树盆栽苗。制备质量浓度为1 000 mg·L-1的脂肽类提取物，15%三唑酮可湿性粉剂稀释1 500倍液。用毛笔刷下保存于橡胶植株叶片上的橡胶树白粉病菌分生孢子，用0.05%吐温20的水溶液配制含量为1×108CFU·mL-1的孢子悬浮液。待橡胶苗古铜叶期时设置7个处理：①脂肽类提取物处理24 h后接种白粉病菌；②接种白粉病菌24 h后脂肽类提取物处理；③三唑酮处理24 h后接种白粉病菌；④接种白粉病菌24 h后三唑酮处理；⑤清水处理作为阴性对照（CK4）；⑥喷甲醇24 h后接种白粉病菌孢子悬浮液；⑦只接种白粉病菌。每处理3株橡胶苗，重复3次。放置于24 ℃、相对湿度80%条件下，10～15 d后参照许文耀[22]的方法调查病情，并计算其病情指数和防治效果。

1.3 数据处理

利用Microsoft Excel 2007、SAS 8.02软件进行统计和分析，应用Duncan新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 Czk1脂肽类物质最小抑菌浓度

Czk1脂肽类物质对橡胶树炭疽病菌的抑菌活性结果（图1A）表明，随着牛津杯中Czk1脂肽类物质质量浓度的逐渐升高，对橡胶树炭疽病菌的抑菌活性逐渐增强，牛津杯周围形成的抑菌圈直径也逐渐增大。当Czk1脂肽类粗提物质量浓度为40 mg·L-1时，牛津杯周围未见明显的抑菌圈，抑菌圈直径仅有2.50 mm；而当质量浓度大于40 mg·L-1时，可以观察到牛津杯周围有明显的抑菌圈存在，因此确定Czk1的最小抑菌质量浓度为40 mg·L-1（图1A）。Czk1脂肽类物质质量浓度为60、80和100 mg·L-1时抑菌圈直径分别为4.20、6.30和7.30 mm。

图1 枯草芽孢杆菌Czk1脂肽类粗提物对橡胶树炭疽病菌菌丝生长的影响Fig.1 Lipopeptide produced by Bacillus subtilis Czk1 inhibit growth of C.gloeosporioides

挑取对照组菌丝和脂肽粗提物处理组抑菌圈周围菌丝在光学显微镜下观察，对照组的橡胶树炭疽病菌菌丝形态正常，表面光滑（图1B）；而脂肽粗提物处理组抑菌圈周围炭疽病菌菌丝顶端呈念珠状，畸形、膨大，出现了菌丝断裂现象（图1C）。这可能是由于脂肽类抗菌物质造成Czk1细胞膜通透性的改变而导致了原生质泄露，致使菌丝畸形膨大、断裂。

2.2 Czk1脂肽类物质对C.gloeosporioides孢子萌发的抑制

不同质量浓度的Czk1脂肽类粗提物对橡胶树炭疽病菌C.gloeosporioides孢子萌发的抑制结果（表1）表明，经过Czk1脂肽粗提物处理后，橡胶树炭疽病菌的分生孢子萌发率均显著低于清水对照组CK1（P＜0.05），随着质量浓度的增大，对孢子萌发的抑制率也逐渐增大，而甲醇对照处理对孢子萌发无抑制作用。利用10、20、40和60 mg·L-1脂肽粗提物处理C.gloeosporioides孢子悬浮液12 h，孢子萌发率分别为30.47%、25.32%、22.23%和20.43%，抑制率分别为57.30%、64.51%、68.84%和71.37%，清水和甲醇对照处理12 hC.gloeosporioides萌发率达70.00%以上，二者无显著差异。用100 mg·L-1的脂肽粗提物处理橡胶树炭疽病菌孢子液12 h，能够完全抑制孢子萌发，并且造成分生孢子顶端畸形膨大（图2）。根据抑制率换算机率值和质量浓度对数，求出毒力回归方程：Y=0.481 5X+6.163 6，相关系数R2为0.986 6，求得Czk1脂肽类粗提物抑制橡胶树炭疽病菌孢子萌发EC50值为3.80 mg·L-1。

表1 枯草芽孢杆菌Czk1脂肽粗提物对橡胶树炭疽病菌孢子萌发的影响Table 1 Effect of Bacillus subtilis Czk1 lipopeptide on spore germination of Colletotrichum gloeosporioides

图2 枯草芽孢杆菌Czk1脂肽粗提物对橡胶树炭疽病菌分生孢子萌发的影响Fig.2 Lipopeptide produced by B.subtilis Czk1 influence spore germination of C.gloeosporioides

2.3 脂肽类抗菌物质对橡胶树炭疽病的抑制效果

由表2可看出，喷施Czk1脂肽粗提物对橡胶树炭疽病有较好的抑制作用，降低了橡胶树炭疽病的发病率。用1 000 mg·L-1脂肽粗提物处理后再接种橡胶树炭疽病菌RC178对橡胶树炭疽病菌的抑制作用最佳，发病率和病斑均较小，其平均发病率为46.70%，平均病斑大小为0.80 cm×0.71 cm，而接种RC178平均发病率高达96.60%，平均病斑大小为1.65 cm×1.40 cm，脂肽粗提物处理后炭疽病发病率降低了49.90%，抑制效果显著（P＜0.05）。随着脂肽粗提物质量浓度降低，对橡胶树炭疽病的抑制作用也随之降低，当脂肽粗提物质量浓度为10 mg·L-1时几乎无抑制效果，发病率高达90.00%，平均病斑大小为1.33 cm×1.08 cm，表明脂肽粗提物接种含量越高其发病率越低，抑制效果越好。甲醇对橡胶树炭疽病菌的侵染无明显抑制作用。

表2 枯草芽孢杆菌Czk1脂肽粗提物对橡胶树炭疽病的抑制效果Table 2 Inhibitory effect of Bacillus subtilis Czk1 lipopeptide on anthracnose of rubber tree in laboratory

盆栽试验结果如表3所示，先喷施1 000 mg·L-1脂肽粗提物再接种橡胶树炭疽病菌RC178，平均发病率为51.80%，仅是在针刺位置形成小病斑，病斑大小为0.59 cm×0.49 cm，病斑未向外扩展，能有效抑制橡胶树炭疽病的发生和蔓延（图3），而接种RC178平均发病率高达95.20%，平均病斑大小为0.87 cm×0.75 cm，脂肽粗提物处理后炭疽病发病率降低了43.40%，抑制效果显著（P＜0.01）。同时发现先喷施脂肽类抗菌物质，当溶剂蒸发后，在橡胶树叶面形成光亮的膜状物，并且脂肽物质量浓度越高，膜状物也越明显。Surfactin能在植物根部形成生物膜保护植物的根部免受病原菌侵入[23]，因而推测这层膜状物为Czk1脂肽所形成的保护膜。

表3 枯草芽孢杆菌Czk1脂肽粗提物对橡胶树炭疽病室内盆栽防效评价Table 3 Control effect of Bacillus subtilis Czk1 lipopeptide on rubber tree anthracnose in indoor pot culture

图3 枯草芽孢杆菌Czk1脂肽粗提物对橡胶树炭疽病的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of B.subtilis Czk1 lipopeptide on anthracnose of rubber tree

2.4 脂肽类抗菌物质对橡胶树白粉病的防治效果

从表4可以看出，喷施1 000 mg·L-1Czk1脂肽粗提物时对橡胶树白粉病有较好的抑制作用，降低了橡胶树白粉病的病情指数。所有处理中，先喷施三唑酮24 h后再接种橡胶树白粉病菌的处理效果最为明显，其防效为52.30%，病情指数比白粉病菌处理降低了37.40；其次为先喷1 000 mg·L-1Czk1脂肽粗提物24 h后喷孢子悬浮液，防效为45.60%，病情指数比白粉病菌处理降低了32.60；接种孢子悬浮液24 h后再喷施三唑酮、接种孢子悬浮液24 h后再喷施脂肽物的防效分别为35.90%和30.20%，病情指数分别降低了25.70和21.60。除喷施三唑酮24 h后喷孢子悬浮液与喷孢子悬浮液24 h后喷施脂肽物病情指数有显著差异外（P＜0.05），其余3个处理间的病情指数无显著差异，甲醇对橡胶树白粉病无明显抑制作用。先喷施三唑酮或者脂肽粗提物，可能在叶片上先占据了一定的空间位点，因此在一定程度上能有效抑制橡胶树白粉病的扩展蔓延。

表4 枯草芽孢杆菌Czk1脂肽粗提物对橡胶树白粉病的抑制效果Table 4 Inhibitory effect of Bacillus subtilis Czk1 lipopeptide on powdery mildew of rubber tree

3 讨论

白粉病和炭疽病是我国橡胶植胶区发生最为严重和最为普遍的叶部病害，是制约橡胶产业健康发展的主要生物因素，目前虽然采用化学药剂可对病害进行控制，但因橡胶树树体高大导致施药器械缺乏、化学药剂利用率低、易造成生态环境污染等诸多问题，生物防治是环保、经济、安全的防控措施之一。近期，本研究组从橡胶树根部分离到枯草芽孢杆菌Czk1菌株，对橡胶树炭疽病菌具有强抑菌活性，并且能够诱导橡胶植株产生系统抗性[24]，由此表明，Czk1菌株具有作为橡胶树炭疽病生防菌的良好潜力。

微生物代谢产物具有抑菌活性是生防资源利用的前提条件。芽孢杆菌以产生抑菌蛋白和脂肽类抗生素等抗菌物质的拮抗作用为重要的防病机理，已成为生防领域研究的热点[25-26]。陈莉等[27]研究发现，短短芽孢杆菌A57无细胞滤液对棉花立枯病菌、枯萎病菌和黄萎病菌的拮抗机理是通过产生拮抗物质造成病菌菌丝体断裂、扭曲和畸形，抑制分生孢子的萌发并造成孢子畸形。候美玲等[28]研究发现，枯草芽孢杆菌YY1菌株所产生的蛋白粗提取液使玉米大斑病菌菌丝由丝状畸变为串珠状，且完全抑制分生孢子萌发并导致原生质体裂解。张涛等[29]研究发现，4株拮抗细菌能够破坏棉花黄萎病菌细胞形态、导致其细胞膜破裂并降低其毒蛋白含量，诱导棉株体内防御酶活性，提高棉花的抗病能力。王宝等[30]报道，解淀粉芽孢杆菌BEB33产生的脂肽类粗提物可导致香蕉枯萎病菌菌丝细胞膨大、细胞膜穿孔、镰刀菌酸产量降低70%，并对香蕉枯萎病有明显防效。本研究中，从橡胶树根分离的B.subtilisCzk1脂肽类粗提物可导致橡胶树炭疽病菌菌丝顶端变为念珠状畸形膨大、出现大量断裂，并抑制炭疽病菌分生孢子萌发，造成孢子顶端畸形，与陈莉等[27]、候美玲等[28]、张涛等[29]、王宝等[30]的研究结果相似，上述研究结果表明，芽孢杆菌产生的抗菌物质影响了病原菌正常生长以发挥抗菌作用。

王雅[31]研究发现，B.subtilisBv10脂肽化合物伊枯草菌素iturin A2、iturin A4对芝麻白绢病菌EC50分别为36.78 和43.03 mg·mL-1。杨丽莉等[32]研究发现，B.subtilisfmbJ产生的脂肽对嗜水气单孢菌的最低抑菌质量浓度为20 μg·mL-1，郝捷等[21]报道的B.vallismortis脂肽粗提物抑制木霉菌的最低质量浓度为20 mg·L-1。本研究中，Czk1脂肽类粗提物质量浓度为10 mg·L-1时抑制橡胶树炭疽病菌孢子萌发的EC50为3.8 mg·L-1，B.subtilisCzk1脂肽对橡胶树炭疽病菌最低抑菌质量浓度为40 mg·L-1，这一结果较杨丽莉等[32]、郝捷等[21]的最低抑菌质量浓度高，可能是不同微生物产生的抗菌物质不同，供试靶标病原菌不一致，以及与试验所用枯草芽孢杆菌发酵提取物为混合物有关。

利用微生物代谢产物可有效防治植物病害。罗楚平等[33]研究发现，B.subtilisBs916脂肽质量浓度为500 μg·mL-1时，对水稻纹枯病防效为70.8%。高振峰等[34]报道，贝莱斯芽孢杆菌ZSY-1脂肽质量浓度200 μg·mL-1时可有效降低番茄早疫病发病率。李明通等[35]发现，侧孢短芽孢杆菌fmb70脂肽质量浓度为26和52 μg·mL-1时，生姜根腐病发病率分别下降了40.0%和56.7%，病情指数分别下降了41.0和58.9。陈梅春等[36]报道，芽孢杆菌FJAT-2349脂肽质量浓度为50 mg·mL-1时，对枇杷炭疽病防效为72.7%。本研究中，B.subtilisCzk1脂肽粗提物质量浓度1 000 mg·L-1时可使橡胶树炭疽病发病率降低49.90%，白粉病病情指数降低32.60，对橡胶树白粉病的防治效果为45.60%。Czk1脂肽物质具有有效降低橡胶树炭疽病和白粉病发病率、抑制病菌生长并延缓病情扩展的生防潜能。本研究仅是在室内及盆栽试验条件下评价Czk1对橡胶树炭疽病和白粉病的抑制作用，其田间防效还有待验证；菌株抑菌物质的成分、参试用量及稳定性等还需深入研究。