PBMC中PPARγ、CD68和CD163表达水平在乳腺疾病诊断中的价值

钱世宁,张 洁,朱小飞

南京中医药大学附属医院医学检验科,江苏南京 210029

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一,近年来其在我国的患病率呈上升趋势,现已居于女性恶性肿瘤首位。目前,临床上乳腺癌的早期诊断主要依靠B超、核磁和钼靶等影像学手段,临床实验室指标和组织穿刺等病理学手段均不能在乳腺癌的早期发现和诊断中发挥良好作用。因此,寻找和建立一种能早期预测和诊断乳腺癌的方法显得尤为重要。过氧化物酶增殖物激活受体(PPAR)是Ⅱ型核激素受体超家族的成员之一,属于配体依赖的转录因子[1]。研究证明[2],PPARγ在乳腺癌的发生发展过程中起重要作用,其经配体激活后可有效抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞分化和凋亡,抑制肿瘤血管侵袭,降低肿瘤细胞的侵袭力。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是外周循环血液中的单核细胞在肿瘤来源的细胞因子和趋化因子作用下迁移到肿瘤微环境中增殖、分化形成的[3]。TAMs根据功能和状态不同分为经典活化的巨噬细胞(M1型)和替代活化的巨噬细胞(M2型)。M1型巨噬细胞高表达促炎因子并激活免疫细胞,杀伤吞噬微生物和肿瘤细胞,并将产生的毒素中间体提呈给T细胞;而M2型巨噬细胞产生大量细胞因子,如:IL-10及转化生长因子-β(TGF-β)等抑制机体免疫反应,促进肿瘤进展。有研究表明[4],TAMs进入肿瘤微环境后诱导形成M2型巨噬细胞,TAMs通过分泌和调控多种细胞因子,促进乳腺癌细胞分裂和转移、癌血管生成以及淋巴管的生成,已逐渐成为乳腺癌研究的新靶点。CD68是巨噬细胞的经典标志物之一,已被广泛用于标志实质性肿瘤浸润的TAMs中,主要识别M1型巨噬细胞[5],而CD163在乳腺癌M2型巨噬细胞中高表达,可作为M2型标志物[6]。既往研究表明,TAMs的检测可作为判断乳腺癌侵袭转移及临床预后的重要指标[7]。本文通过检测CD68和CD163在乳腺疾病患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达差异性,阐明TAMs相关分子标志在乳腺良恶性疾病诊断中的价值。孕激素受体(PR)是目前乳腺癌免疫组织化学的重要指标之一,作为乳腺癌诊断和判断预后的重要影响因素。本文研究PPARγ、CD68和CD163在乳腺疾病患者外周血PBMC中的表达差异,并结合三者与PR表达相关性,可以为临床乳腺疾病的诊疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 根据临床病例信息收集2018年1月至2020年12月于本院因乳腺疾病就诊的患者及健康女性的EDTA抗凝外周血样本共47例,均为女性,平均年龄43.2岁。其中经病理学确诊为乳腺癌者33例,未经手术治疗者13例,术后患者20例;乳腺纤维瘤患者6例,同期选取健康体检女性33例,作为健康对照组,4组间年龄、性别等一般资料差异无统计学意义(P=0.13)。本研究涉及的病患数据和样本均通过南京中医药大学附属医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 淋巴细胞分离液(上海新睿生物科技有限公司)、三氯甲烷、异丙醇溶液、75%乙醇、TRIzol Reagent(Invitrogen公司)、Prime ScriptTM反转录PCR试剂(大连宝生物工程有限公司),SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂(大连宝生物工程有限公司),PCR引物合成由大连宝生物工程有限公司完成;高速台式离心机(北京白洋医疗器械有限公司)、恒温培养箱(上海煜南仪器有限公司)、数显恒温水浴锅(基隆)、恒温混匀仪(杭州瑞诚仪器有限公司),ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司),Eppendorf Bio Photometer Plus核酸蛋白测定仪(Eppendorf公司)。

1.3方法

1.3.1PBMC的分离 取新鲜EDTA抗凝外周血,吸取2 mL淋巴细胞分离液加入10 mL分离管中,混匀备用全血标本,沿分离管管壁缓慢加入到分离液上,1 500 r/min离心30 min,吸取灰白层即单个核细胞层至1.5 mL EP管中,再于高速冷冻离心机中13 000 r/min,4 ℃离心5 min,收集细胞沉淀于-80 ℃保存备用。

1.3.2RNA提取和qPCR检测PPARγ、CD68、CD163的表达水平 使用Trizol试剂提取PBMC总RNA。通过qPCR方法检测PPARγ、CD68、CD163的mRNA水平,引物序列如下。PPARγ,上游:5′-TGGAGTTCATGCTTGTGAAG-3′,下游:5′-GCA TTA TGAGACATCCCCAC-3′;CD68,上游:5′-TTCCCCTATGGACACCTCAG-3′,下游:5′-TTGTACTCCACCGCCATGTA-3′;CD163,上游:5′-AAAAAGCCACAACAGGTCGC-3′,下游:5′-CTTGAGGAAACTGCAAGCCG-3′。采用2-ΔΔCt法计算相对表达水平。

1.3.3收集CEA和CA153检测数据 从医院的电子病历系统中收集乳腺癌患者术前、术后及乳腺纤维瘤患者CA153检测结果。

2 结 果

2.1CEA和CA153在良恶性乳腺疾病中表达水平的比较 本文比较了CEA和CA153这两种肿瘤标志物在乳腺癌术前、术后和乳腺纤维瘤患者三组之间的表达水平。CEA在乳腺癌术前组较术后组表达水平(P=0.31),在乳腺癌术后组较乳腺纤维瘤组表达水平(P=0.22),在乳腺癌术前组较乳腺纤维瘤组表达水平(P=0.74),差异均无统计学意义;同样,CA153在乳腺癌术前组较术后组表达水平(P=0.67),在乳腺癌术后组较乳腺纤维瘤组表达水平(P=0.58),在乳腺癌术前组较乳腺纤维瘤组表达水平(P=0.82),差异均无统计学意义。见图1。CEA和CA153不能作为乳腺疾病鉴别诊断和预后判断的有效指标。

图1 CEA和CA153在乳腺癌术前、术后和乳腺纤维瘤患者中的表达。

2.2PPARγ、CD68和CD163在乳腺癌术前、术后和乳腺纤维瘤患者之间的表达水平和差异 本研究检测了PPARγ、CD68和CD163在健康对照人群,乳腺癌术前、术后患者和乳腺纤维瘤患者样本中的表达水平,以健康对照人群的表达水平作为基准。与健康对照人群相比,乳腺癌术前患者的PPARγ表达显著降低(P<0.001),而乳腺纤维瘤患者的PPARγ表达则明显增高(P<0.05)。不仅如此,PPARγ在乳腺癌术后患者样本中的表达明显增高,与乳腺癌术前患者比较差异有统计学意义(P<0.01)。CD68在三组之间的表达水平和差异与PPARγ相似。除此之外,CD163在三组之间的表达也存在差异。其中,CD163在乳腺癌术前患者的表达水平最高,显著高于健康对照组(P<0.05)、术后组(P<0.05)和乳癌纤维瘤组患者(P<0.05)。见图2。上述结果提示,PPARγ、CD68和CD163可能是鉴别乳腺疾病良恶性和预后判断的潜在指标。

图2 PPARγ、CD68和CD163在健康对照、乳腺癌术前、术后和乳腺纤维瘤患者中的表达水平和差异情况

2.3ROC分析PPARγ、CD68和CD163对乳腺癌的诊断效率 PPARγ在乳腺癌术前、术后和乳腺纤维瘤患者中的ROC曲线分析显示,ROC曲线下面积分别为0.89、0.93和0.93,临界值分别为0.77、1.08和0.78,灵敏度分别为88.89%、80.00%和85.71%,特异度分别为87.50%、87.50%和88.89%。CD68在乳腺癌术前、术后和乳腺纤维瘤患者中的ROC分析显示,ROC曲线下面积分别为0.79、0.83和0.90,临界值分别0.77、1.08和1.16,灵敏度分别为77.78%、80.00%和57.14%,特异度分别为87.50%、87.50%和88.89%;CD163在乳腺癌术前、术后和乳腺纤维瘤患者中的ROC分析显示,ROC曲线下面积分别为0.86、0.54和0.85,临界值分别为1.08、1.08和1.28,灵敏度分别为77.78%、33.33%和85.71%,特异度分别为87.50%、87.50%和77.78%。根据ROC曲线分析的结果,PPARγ在乳腺癌和乳腺纤维瘤中均具有较高的灵敏度和特异度,诊断效能较高;而CD68对于乳腺癌和乳腺纤维瘤的诊断均具有较高的特异度,在乳腺癌中也具有较高灵敏度,但对于乳腺纤维瘤的诊断灵敏度较低;CD163在乳腺癌和乳腺纤维瘤诊断中的特异度较高,但对乳腺癌术后患者的灵敏度过低。因此,PPARγ、CD68和CD163在乳腺癌和乳腺纤维瘤的鉴别诊断和预后判断中具有一定作用。

2.4PPARγ、CD68和CD163表达水平与乳腺癌组织中PR表达的相关性分析 乳腺癌患者PBMC中PPARγ表达水平与癌组织中PR的表达呈正相关(r=0.92,P<0.001);CD68表达水平与癌组织中PR的表达也呈正相关性(r=0.96,P<0.001);而CD163表达水平与癌组织中PR的表达呈负相关(r=0.91,P<0.001)。上述结果表明,PPARγ、CD68和CD163表达水平与乳腺癌组织中PR的表达存在着相关性,提示三者可能作为乳腺癌诊断和判断预后的潜在指标。见图3。

注:左、中、右依次为PPARγ、CD68和CD163表达水平与PR的相关性分析。

3 讨 论

过氧化物酶增殖物激活受体(PPARs)根据结构特征分为三种亚型:PPARα、PPARβ、PPARγ,其中PPARγ是研究最多的亚型[2]。PPARγ经与配体结合后激活,从而与维A酸类X受体(RXR-α)形成异源二聚体,入核与目标基因的过氧化物酶体增殖体反应元件(PPRE)结合,激活目的基因转录,引起相应的生物学效应[8]。有实验研究证明[9],PPARγ激动剂罗格列酮(ROZ)可抑制乳腺癌细胞(MCF-7)增殖并诱导其凋亡。江颖等[1]实验证明PPARγ与TNM分期、肿瘤组织学分级呈负相关,PPARγ在良性乳腺组织中的表达强度高于乳腺癌组织。这些发现与本实验中观察到的PPARγ在乳腺纤维瘤患者PBMC中表达水平高于乳腺癌患者的现象一致。另多项研究证明[1,10-12],PPARγ与PR表达呈正相关,其高表达与乳腺癌患者总生存率正相关,是预后良好的重要指标。本文同样也观察到乳腺癌患者PBMC中PPARγ的表达水平与癌组织中PR的表达存在着正相关性,说明患者外周血PBMC中的PPARγ同样能够反映肿瘤本身的特性。

TAMs与肿瘤的发生和进展存在相关性。既往研究显示[3,13-16],TAMs在乳腺癌中的浸润程度与肿瘤分级、激素状态有关。良性乳腺疾病中TAMs的浸润密度明显低于其在乳腺癌组织中的密度,提示TAMs可能具有用于乳腺癌诊断筛查的潜在价值。TAMs主要包括M1和M2两种类型的巨噬细胞,其中M1型巨噬细胞可表达促炎因子并激活免疫细胞,具有增强免疫反应和杀伤肿瘤细胞的功能;而M2型巨噬细胞主要产生抑制性细胞因子抑制免疫反应,促进肿瘤进展。由于肿瘤血供和机体血流存在着联通交换的病理特征,因此外周血中的PBMC可能通过肿瘤血供进入肿瘤微环境转化成为M2型巨噬细胞,促进肿瘤进展;而另一方面肿瘤微环境中的TAMs也可能通过血流途径进入外周循环,从而使得通过监测外周血PBMC的极性状态预测肿瘤发生发展成为可能。本文首次通过检测外周血PBMC中TAMs标志分子CD68和CD163的表达水平,同样发现了CD68和CD163分子在健康人群、乳腺癌患者和良性乳腺纤维瘤患者之间的显著差异,并通过ROC曲线分析提示两种分子对乳腺癌和乳腺纤维瘤患者具有较高的诊断效率。值得注意的是,CD68在乳腺癌患者PBMC中的表达水平显著低于其在正常组织和良性乳腺疾病组织中的水平,可能原因在于PBMC由单核巨噬细胞和淋巴细胞等单个核细胞组成,乳腺癌患者外周循环池中的单核巨噬细胞被肿瘤细胞招募至肿瘤微环境极化形成M2型巨噬细胞参与肿瘤进展[17-18],从而导致外周PBMC中CD68相对表达水平降低。

除此之外,TAMs还与肿瘤组织中ER、PR和Her2等受体表达有关[19]。尽管PR作为单独指标对乳腺癌诊断价值不大,与患者年龄、肿瘤体积、有无淋巴结转移、肿瘤分期及组织学类型的差异也无统计学意义,但其与ER、p53及c-erbB-2等联合检测可用来指导临床用药和预后判断[20]。本实验结果表明外周血PBMC中CD68和CD163分别与乳腺癌组织中PR表达呈正、负相关性,因此可将CD68和CD163纳入早期联合诊断指标之中,提高乳腺癌诊断的准确性。

本文同时研究PPARγ和TAMs相关标志在乳腺良恶性疾病中的表达及诊断价值是基于二者在乳腺疾病中作用机制的共通之处。研究表明:M2型巨噬细胞受低氧刺激分泌VEGF,诱导血管生成并招募更多的巨噬细胞至肿瘤微环境[4],以正反馈方式调控肿瘤微环境的血管生成,而PPARγ配体15d-PGJ2等能有效抑制肿瘤细胞VEGF及其受体表达,从而抑制肿瘤血管生成[21]。在对乳腺癌细胞的增殖、分化和侵袭的调控方面,TAMs可被MCF-7刺激分泌大量IL-6,经JAK2-STAT3通路活化后,增加靶基因TGF-β1、HIF-1a转录,激活癌干细胞,促进肿瘤生长和转移[22],而配体介导的PPARγ激活可阻滞TAMs向M2型巨噬细胞转化,抑制M2型“促癌”作用发挥[22-23]。种种迹象表明,PPARγ在TAMs极化过程中发挥了重要作用。因此本实验联合检测TAMs分子标志(CD68和CD163)以及PPARγ在乳腺良恶性疾病中的表达,并且发现PPARγ表达水平与TAMs极化状态存在密切关联。

综上所述,本文研究了外周血PBMC中PPARγ和TAMs标志分子(CD68和CD163)在乳腺疾病患者的差异性表达,初步探讨了三种分子与肿瘤组织PR表达的相关性,为临床乳腺疾病的诊断和预后判断提供了新方法和新思路。