miR-155、PDCD4、GSN在高血压性脑出血中的表达及预后价值研究*

裴献光,魏海亮,高 芳,许亚宁,王志强

邯郸市第一医院:1.神外一科;2.外三科,河北邯郸 056002

脑出血是由颅内微小动脉瘤破裂引起的出血,占所有脑卒中的20%左右,与高血压关系密切,脑出血患者中有95%伴高血压[1-2]。高血压性脑出血(HICH)是长期高血压导致颅脑内小动脉管壁破裂发生变性、缺血、坏死等病理改变而造成血管破裂出血的疾病,多见于中老年[3]。我国HICH发病率逐年增加,发病凶险,患者常表现为意识障碍、肢体乏力,严重者可出现大小便失禁、抽搐、昏迷症状,其病死率和病残率均较高,部分HICH患者治疗后仍存在神经功能障碍,3个月内病死率最高可达18.4%[4-5]。因此,寻找特异性指标对评估HICH的严重程度和预后尤为重要。微小核糖核酸(miRNA)-155(miR-155)与肿瘤、免疫、造血、炎症有关,在脑组织缺血缺氧过程中可加重组织损伤[6]。程序性细胞死亡蛋白4(PDCD4)属细胞死亡因子,参与细胞增殖、凋亡过程,PDCD4与脑出血有关[7]。凝溶胶蛋白(GSN)属肌动蛋白结合蛋白,具有清除肌动蛋白、减轻机体损伤的作用[8]。miR-155、PDCD4、GSN均在HICH疾病中发挥重要作用,但作为临床检测指标,三者同时在HICH患者中进行检测的报道较少,因此,本研究旨在探讨miR-155、PDCD4、GSN在HICH中的表达情况及用于预测HICH患者预后的价值,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2021年1月至2022年1月本院收治的150例HICH患者纳入研究作为研究组,男86例,女64例;年龄45～70岁,平均(53.68±6.75)岁;体重指数21～25 kg/m2,平均(23.65±1.31)kg/m2;高血压病程2～8年,(平均3.68±0.54)年;84例有吸烟史,73例有饮酒史,75例合并糖尿病,67例合并冠心病。另外,选取同期于本院治疗的150例无脑出血的高血压患者作为对照组,男80例,女70例;年龄45～68岁,平均(52.87±6.71)岁;体重指数21～25,平均(23.73±1.20)kg/m2;高血压病程2～7年,平均(3.61±0.52)年;76例有吸烟史,61例有饮酒史,65例合并糖尿病,60例合并冠心病。本研究经本院医学伦理委员会批准。纳入研究者或其直系亲属对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2纳入与排除标准 纳入标准:(1)研究组患者符合《高血压性脑出血》[9]中HICH的诊断标准,经影像学头颅CT检查显示高密度影像,既往有高血压史,首次发病,发病6 h内入院,有HICH所致神经功能缺损症状,确诊为HICH;(2)对照组患者在未使用高血压药物情况下,收缩压≥140 mmHg或(和)舒张压≥90 mmHg,确诊为高血压,经头颅CT检查未发现高密度影像。排除标准:(1)伴凝血功能异常、脑疝、血管病变、严重精神疾病者;(2)外伤所致脑出血,伴有传染性、免疫性疾病、严重感染者;(3)存在脑部及其他恶性肿瘤者。

1.3方法

1.3.1标本采集 取患者空腹静脉血5 mL,以3 500 r/min离心10 min待测。

1.3.2miR-155检测 使用联迈生物Trizol试剂盒分离得到细胞RNA,使用净信实业公司的核酸定量检测仪检测其浓度、纯度,以总RNA为模板,经过逆转录得到cDNA,然后进行实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测。反应条件:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。miR-155引物序列为F:5′-CTCGTGGTAATGCTAATTGTGA-3′,R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。以U6为内参,U6引物序列为F:5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′,R:5′-GTGCAGG GTCCGAGGT-3′。以U6作为内参基因,最后用2-ΔΔCt法计算miR-155相对表达水平。

1.3.3PDCD4检测 采用莼试生物公司的人PDCD4酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行检测,分别设置空白孔、标准孔、待测样品孔,标准孔加入标准品50 μL,待测样品孔先加样品稀释液40 μL,再加待测样品10 μL,混匀后置37 ℃下温育30 min,甩去孔内溶液,拍干,加满洗涤液静置30 s后甩去孔内溶液,拍干,反复5次,除空白孔外每孔加酶标试剂50 μL,再次温育洗涤,加入显色剂A、B各50 μL,37 ℃避光显示15 min,每孔加50 μL终止液,在450 nm波长处测吸光度值。

1.3.4GSN检测 采用仑昌硕生物公司的GSN ELISA试剂盒检测,设置标准孔、待测样品孔并加入200 μL标准品、待测样品,空白孔不加,混匀后置于37 ℃ 60 min,甩去孔内溶液,拍干,用洗涤液洗板3次,每孔加入200 μL封闭液,置于37 ℃ 60 min,用洗涤液洗板3次,甩干,加入200 μL稀释液,37 ℃放置120 min,洗涤3次,甩干,加入200 μL辣根过氧化物酶羊抗兔抗体,37 ℃放置60 min,再次洗涤3次,甩干,加入底物200 mL于暗处反应15 min,每孔加入50 μL终止液混匀,在450 nm处测吸光度值。

1.4观察指标 (1)比较研究组、对照组患者miR-155、PDCD4、GSN水平。(2)比较HICH不同严重程度患者miR-155、PDCD4、GSN水平,严重程度以美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分[10]进行评估,共有11个项目,总分为42分,轻度0～7分、中度>7～15分、重度>15～42分,分数越高,神经受损程度越严重。(3)比较HICH不同预后患者miR-155、PDCD4、GSN水平,预后情况采用格拉斯哥(GOS)[11]评分评估,总分数为1～5分,1分为死亡,5分为痊愈,分值越高,表明预后越好,将1～3分记为预后不良组,4～5分记为预后良好组。(4)分析miR-155、PDCD4、GSN与HICH严重程度、HICH预后的相关性。(5)比较HICH不同预后患者一般资料,包括性别、男性、体重指数、吸烟史、饮酒史、糖尿病史、冠心病史,出血量、收缩压、舒张压、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C);采用迈瑞全自动生化分析仪BS-280检测患者甘油三酯、总胆固醇、LDL-C、HDL-C。(6)采用Logistic回归分析HICH患者预后不良的危险因素。(7)分析miR-155、PDCD4、GSN单独及联合检测对HICH患者预后不良的预测价值,并绘制受试者工作特征(ROC)曲线。

2 结 果

2.1miR-155、PDCD4、GSN水平比较 研究组miR-155和PDCD4水平高于对照组(P<0.05),GSN水平低于对照组(P<0.05),见表1。

表1 研究组和对照组患者miR-155、PDCD4、GSN水平比较

2.2不同严重程度HICH患者miR-155、PDCD4、GSN水平比较 经NIHSS评分评估,150例HICH患者中,轻度53例,中度64例,重度33例;随HICH严重程度加重,miR-155、PDCD4水平增高,GSN水平降低(P<0.05),见表2。

表2 不同严重程度HICH患者miR-155、PDCD4、GSN水平比较

2.3不同预后HICH患者miR-155、PDCD4、GSN水平比较 经GOS评分评估,150例HICH患者中,预后良好109例,预后不良41例;预后不良组miR-155和PDCD4水平高于预后良好组(P<0.05),GSN水平低于预后良好组(P<0.05),见表3。

表3 不同预后HICH组miR-155、PDCD4、GSN水平比较

2.4miR-155、PDCD4、GSN与HICH严重程度、HICH预后的相关性分析 miR-155、PDCD4与HICH严重程度呈正相关(r=0.653、0.642,P<0.05),与HICH预后呈负相关(r=-0.625、-0.575,P<0.05);GSN与HICH严重程度呈负相关(-0.591,P<0.05),与HICH预后呈正相关(r=0.583,P<0.05),见表4。

表4 miR-155、PDCD4、GSN与HICH严重程度、HICH预后的相关性分析

2.5HICH不同预后患者一般资料比较 预后不良组出血量≥60 mL占比高于预后良好组(P<0.05),见表5。

表5 HICH不同预后患者一般资料比较或n(%)]

2.6HICH患者预后不良危险因素的Logstic回归分析 miR-155、PDCD4水平升高,GSN水平降低是HICH患者预后不良的危险因素(P<0.05),见表6。

表6 HICH患者预后不良的Logstic回归分析

2.7miR-155、PDCD4、GSN单独及联合检测对HICH患者预后不良的预测价值分析 miR-155、PDCD4、GSN联合检测对HICH患者预后不良进行预测的曲线下面积(AUC)为0.954,高于miR-155、PDCD4、GSN单独检测的0.877、0.763、0.801(P<0.05),见表7、图1。

图1 miR-155、PDCD4、GSN单独及联合检测用于预测HICH患者预后不良的ROC曲线

表7 miR-155、PDCD4、GSN及联合对HICH患者预后不良的预测价值分析

3 讨 论

HICH是中老年常见疾病之一,患者起病较急,表现为突然头部剧痛,频繁呕吐,收缩压高达180 mmHg以上。80%的HICH发生在幕上,由于长期高血压影响,患者血管承受的冲击较大,导致脑动脉内膜细胞受损,使内膜出现粥样硬化,形成细小动脉瘤,当患者血压突然升高时,动脉瘤破裂则出现脑出血[12]。临床治疗中,一般根据脑出血患者自身情况、脑出血的部位以及出血量选择保守治疗、开颅手术或者微创手术,但患者病死率仍居高不下,部分患者经治疗后仍会有残疾[13]。因此,寻找能有效反映HICH患者病情严重程度和预后的指标至关重要。

miRNA在心脑血管疾病的发生、发展中起重要作用,miR-155具有多种功能基因,由可活化的B细胞、T细胞、巨噬细胞等免疫、炎症细胞产生,与多种疾病的发生密切相关,miR-155可作为促炎症分子加剧炎症过程,而炎症反应是脑出血继发性损伤的主要机制[14]。有研究显示,高血压患者中,miR-155可通过调节血管中血管紧张素Ⅱ-1型受体的表达,进而参与高血压的发生、发展[15]。本研究中HICH患者miR-155水平高于无脑出血的高血压患者,主要是HICH患者发生脑出血后脑组织中存在炎症反应,外周循环系统中miRNA表达可出现动态变化,miR-155在循环系统中稳定性较高,当脑组织出现缺血缺氧后,其水平可快速上升。刘亚菲等[16]的研究表明,miR-155在HICH患者中的水平明显升高,与血肿体积呈正相关,可作为判断HICH患者预后的重要指标。本研究中,根据NIHSS评分将HICH患者病情分为轻度、中度、重度,结果显示,随着患者病情严重度增加,miR-155水平不断升高。预后不良患者miR-155水平明显高于预后良好患者。miR-155水平与疾病严重程度呈正相关,与预后呈负相关。miR-155水平升高是HICH患者预后不良的危险因素,提示miR-155可作为预测HICH患者预后的指标。买买江·阿不力孜[17]报道,脑出血患者miR-155水平较高,脑出血死亡患者血标本中miR-155水平显著高于存活者,同时miR-155水平可用于预测患者6个月内的生存预后,并与NIHSS评分呈正相关。此外,王帆等[18]的研究表明,miR-155水平随NIHSS评分升高而逐渐增高,在预后不良患者中显著上升,可用于评估患者病情严重程度和预后。以上研究结果与本研究结果相似。

PDCD4是凋亡过程中上调的基因,分布在各类组织器官中,在肝癌、肺癌、脑肿瘤中研究较多,且其为低表达,可促进癌细胞侵袭、扩散,又被称为抑癌基因[19-20]。PDCD4是细胞凋亡过程中发现的特定调节基因,其水平在细胞凋亡中升高,如在小鼠脑出血的研究中,PDCD4水平较高,由于脑出血后神经元凋亡或死亡是最严重后果,因此认为PDCD4表达上调可能与促神经元凋亡有关[21]。梁丽英等[22]的研究表明,miR-21能够通过靶向调控PDCD4,进而抑制心肌细胞凋亡。本研究中,研究组PDCD4水平高于对照组,并随着患者病情增加而上升,在预后不良患者中PDCD4水平明显高于预后良好患者,与疾病严重程度呈正相关,与预后呈负相关,是HICH患者预后不良的危险因素,提示PDCD4可作为预测NICH患者预后的指标。高倩等[23]研究表明,PDCD4在脑梗死患者中水平较高,并随损伤程度增加而增加,PDCD4有助于早期诊断脑梗死。董雨等[24]研究认为,PDCD4水平对HICH预后评估具有一定价值,在HICH患者中水平显著升高,是HICH预后不良的危险因素。

GSN是一种中等大小的蛋白质,由375个氨基酸残基组成,其编码基因的长度约为70 kb,能调节肌动蛋白聚合解聚,同时在细胞运动、控制细胞程序性死亡等细胞活动中发挥重要作用。张宛越等[25]的研究表明,GSN在急性脑出血患者中水平较低,并与病情严重程度、预后有关,可作为预后判断指标。本研究中,研究组GSN水平低于对照组,并随着患者病情加重而降低,在预后不良患者中GSN水平明显低于预后良好患者,是HICH患者预后不良的保护因素,提示GSN可作为预测HICH患者预后指标。原因为HICH可导致组织损伤,细胞间隙会释放激动蛋白,使机体微循环受阻,引起微血栓形成和内细胞损伤,造成多器官损伤,而GSN可快速与肌动蛋白结合,降低毒性,保护机体。杨学丽等[26]研究表明,GSN在急性脑出血预后不良患者中水平较低,与其他指标结合可有效评估患者病情严重程度和预测预后。李爱华等[27]的研究表明,GSN水平随患者神经缺损程度加重而增高,在预后不良的患者中降低,与疾病严重程度呈负相关,对脑出血患者预后的预测价值较高,监测该指标有助于更好地采取干预措施。以上研究结果均与本研究结果相似。本研究结果还显示,预后不良患者出血量≥60 mL占比较高,预后不良患者出血量较多,出血量较多对脑组织损伤较大,患者容易合并脑疝,遗留后遗症,本研究发现,PDCD4预测HICH患者预后不良的AUC为0.763,灵敏度、特异度分别为70.7%、81.7%,而董雨等[24]研究显示,PDCD4预测HICH患者预后不良的AUC为0.834,灵敏度、特异度分别为71.08%、68.35%,可能是因为本研究样本量较小而导致结果不一致。本研究结果中,GSN预测HICH患者预后不良的AUC为0.801,张宛越等[25]的研究显示,GSN预测患者预后不良的AUC为0.748,与本研究相比较低,可能与样本量有关,而李爱华等[27]研究显示GSN预测患者预后不良的AUC为0.877,相比本研究的0.801较高,导致其结果的原因可能是由于本研究选取患者为HICH患者,而李爱华等[27]研究选取对象为急性脑出血患者,研究对象可能存在差异而导致结果不一致。miR-155、PDCD4、GSN联合检测对HICH患者预后不良的预测价值优于单项指标预测。由于本研究样本量较小,对miR-155、PDCD4、GSN在HICH预后不良发生机制中的作用未进行详细分析,结论难免存在偏倚。

综上所述,miR-155、PDCD4在HICH患者中呈高表达,GSN呈低表达。miR-155、PDCD4水平升高,GSN水平降低是HICH患者预后不良的危险因素,联合检测这3项指标对HICH患者预后有一定的预测价值。