基因扩增技术在食品检测中的质量控制要点

王 磊

（天津市食品安全检测技术研究院，天津 300308）

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是基因扩增检测技术最主要的应用方向，其原理为通过从样本中提取核酸并进行扩增，分析目标基因序列，最终获得样本的物种信息。经过多年发展，该技术以普通PCR为基础，已衍生出多重PCR、实时荧光定量PCR、数字PCR等多种应用途径，并以其省时高效的优点被广泛应用于食品安全等检测领域[1]。本文结合实际工作经验，对PCR检测技术的主要应用范围进行论述，针对内、外源影响因素，对检测的质量控制要点进行了总结，以期为相关实验室的建设提供参考依据。

1 基因扩增技术在食品检测中的主要应用

1.1 致病性微生物检测

食源性致病微生物检测一般以致病菌为主，其常规检测方法为培养法，耗费时间长。PCR技术作为其辅助手段，既可以用于检测末端对菌株进行鉴定，也可用于前端对增菌液进行初筛，具备灵活准确的特点，但其囿于原理，无法考查微生物的生物活性。目前，PCR技术用于致泻大肠埃希氏菌和诺如病毒的检测方法已经被食品安全国家标准采用，用于沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等常见致病菌的鉴定方法及商品化试剂也已被相继研发。

1.2 动物源性成分检测

动物源性成分鉴定主要用于肉制品掺假的检测[2]，目前猪、牛、羊、马、驴、鸡和鸭等常见畜禽肉类的鉴定都已建立了相应标准。其中，以实时荧光PCR的应用较为突出，其优势在于通过建立已知拷贝数的标准曲线，比对计算出目标拷贝数的初始含量，实现成分的相对定量分析。另外，可进行多种成分同时测定的多重PCR技术也逐渐得到应用。

1.3 过敏原成分检测

食品过敏原包括甲壳类、鱼类、蛋类、牛奶、花生、坚果、大豆、小麦以及芝麻等成分，现阶段针对该类成分的检测标准主要是用于出口食品的行业标准，方法上以荧光定量PCR法为主。与依赖于分析特定蛋白的方法相比，荧光定量PCR方法在检测中显示出较高的灵敏度和可靠性，更容易满足该类成分微量、痕量的检出需求[3]。

1.4 转基因成分检测

转基因成分是最早应用基因扩增检测技术的食品类别，普通PCR和荧光PCR技术在该领域中占主导地位。我国现已经颁布了包括通用要求和具体种类品系的一系列检测标准，形成了比较完备的体系。实际检测中需要考虑到领域中内源基因、外源基因、启动子、终止子等特定概念[4]，对引物设计、结果判定等步骤进行系统性考量。

2 基因扩增检测技术的质量控制要点

2.1 人员的控制

实验室对检测人员应进行定期培训，重点在于分子生物学相关专业知识、实验操作技能、规范化操作、污染预防处置办法和生物安全等内容。同时实验室应定期组织或参加实验室间比对试验，通过考核训练提升检测人员的操作技能。

PCR反应实验具有精细微量的操作特点，检测人员的业务熟练程度和责任心成为主导检测结果有效性的决定性因素。因此，检测人员必须严格执行质量体系规定的检测流程、检测方法，杜绝因操作不细致导致的结果异常甚至交叉污染的发生，同时也要求实验室在质量监督活动中对检测人员的实验作风和实验习惯加以重点考察。

2.2 仪器设备的控制

作为实现检测过程的重要核心条件，PCR扩增仪、实时荧光定量PCR仪、生物安全柜、天平、低温离心机、核酸浓度测定仪和移液器等仪器设备要按照规程要求定期进行维护、期间核查、检定校准，保证其在规定参数内正常运行。同时应制定相应的设备防护程序，避免操作中核酸或试剂泄露对设备造成不良影响。

2.3 样本和试剂耗材的控制

2.3.1 样本

样本的处理应按照方法和作业指导书严格进行，做好编号和相应登记。检测人员根据样本类型采取相适应的方式进行保存。制备样本应及时进行核酸提取，核酸若需暂时储存，应于-20 ℃以下保存，避免反复冻融；需要长时间保存的应储存于-80 ℃条件下，保存期不宜超过6个月。

2.3.2 试剂和耗材

试剂质量直接影响PCR反应的检测结果，故不得使用伪劣或过期试剂。实验室应对每批次购进的新试剂与保存的阴、阳性标本进行同条件验证试验，质量验收合格后方可使用。试剂保存应严格按照说明书放置在恒温环境和专用冰箱中，未开封试剂与已部分使用试剂分开放置。需低温保存又要经常使用的试剂需分装后贮存备用，避免反复冻融和打开容器影响试剂质量，同时减少实验室的偶然性污染机会。

实验室各功能区所用的手套、移液器吸头、离心管、反应管等物品均应一次性使用；加样环节选用带滤芯移液器吸头，以防操作过程中引入污染。

2.4 检测方法的控制

基因扩增实验室应依据检测方法制定相应的标准操作规程，明确相关注意事项，规程应涵盖试剂准备、测定方法和仪器操作等内容。针对PCR实验的特性，实验室还需制定相应的试剂登记验收程序、清洁程序、污染控制及消除程序和过程控制程序以保证检测结果的有效性。在明确区分检测项目个体化差异的基础上，实验室应根据具体情况对试验程序进行规范完善，并定期对其进行检查核对，持续改进，确保其时效性和适用性，做到检测过程有章可循，检测记录有据可查。

2.5 检测环境的控制

2.5.1 实验室功能区域的划分

基因扩增实验室应具有充分、合理的空间，良好的照明和通风设备，并遵照检测工作流程，按单向流动原则进行规范化分区。一般按照GB/T 27403——2008、GB/T 19495.2——2004将实验室分隔为试剂配制和贮存区、样品制备区、PCR反应配制区、扩增区和产物分析区5个工作区；也可按照GB/T 32146.3——2015分隔为试剂准备区、样本制备区、扩增区和产物分析区4个工作区，实验室应根据自身硬件条件和检测方向需求，合理布局规划[5]。

要求各功能区必须互相独立，采取空间隔离并明确标识，应各自设有缓冲间，供更换工作服用；检测空间应相对封闭，避免频繁的空气对流产生；各区的仪器设备、实验用品和清洁工具必须专用，不得混用；各区应具备通风装置，以便及时排除空气中的核酸气溶胶。最终实现检测过程单向的操作流、人流、物流以及气流，尽可能预防核酸污染对检测结果造成干扰。

2.5.2 实验室内部环境的控制

实验室内部环境应始终围绕预防和避免核酸污染这一原则进行控制。每次实验操作前后应用紫外线照射整个试验区域（≥30 min）；定期采用10%次氯酸钠或1%过氧乙酸擦拭地面及工作台以破坏残留的核酸，并对实验室进行换气和消毒，预防空气中气溶胶污染源。

各区试验结束后废弃的样本、反应管、移液器吸头等物品应就地及时置于盛有10%次氯酸钠的容器中浸泡（≥6 h），同时涉及微生物操作的所有废弃物必须经过高压灭菌并按医疗垃圾物处理，从而在实验用品、设施和空气环境中彻底控制污染源。

2.6 检测过程的控制

2.6.1 核酸提取

核酸的提取是关系检测结果是否成立的关键步骤，因此操作过程必须注意避免标本间的交叉污染及核酸模板的降解、丢失。提取所采用的吸头、离心管的品质，开盖、吸弃上清液等操作是否正确均会对检测质量造成影响，检验人员必须时刻注意。

对于DNA的提取，建议采用操作相对简便、人为影响因素较少的柱膜法或磁珠法，以取代传统的CTAB抽提法；某些病毒检测中则需制备RNA扩增样本，在提取完成后应立即进行逆转录操作，合成较为稳定的cDNA，以便于保存。

2.6.2 反应液的配制

反应体系的配制是PCR检测准确率的保障，应按试验设计配制反应液。开关微量离心管时须双手操作，手部应以最小面积接触管上方，不得触及管盖内面；Taq酶、引物等试剂在开盖前应低速瞬时离心，使附在管壁和管盖的液体沉于管底，保证试剂浓度一致；应尽量减少试剂的开盖次数和时间，防止空气、吸头、溅沫等污染试剂，同时为确保实验体系的均一性，应对最终反应液反复抽吸混匀；考虑到吸取、分装试剂时的误差，所配制的反应液应比理论用量多出1～2孔的余量，以免实际用量不足。

空白对照、阴性对照和阳性对照是反应过程中最重要的主动质控方式，每次检测实验必须同时伴随进行。加样顺序遵从核酸浓度由低到高的顺序：①空白对照；②阴性对照；③样品；④由低到高浓度加入标准品（定量实验）；⑤阳性对照。

2.6.3 扩增和扩增产物的分析

PCR反应上机操作中，检测人员应确保8联排管或96孔板平衡放置；反应管加盖或膜时，不得用记号笔标记，也不可触摸管盖或膜的下表面。

扩增产物在电泳操作上样时应避免加样液的溢出和点样孔内有气泡产生，避免PCR产物漂移到其他孔而影响结果判定；实验结束后应立即对废弃物进行无害化处理，严防产物核酸进入空气，形成污染源。

3 结语

综上，随着我国食品安全保障水平的不断提升，PCR技术在基层检测机构得到推广，现已经逐渐向普及化和常规化方向发展。由于该技术的高敏感特性，某些细微不确定因素即可导致假性（阴、阳）结果产生。为应对此情况，实验室必须制定全方位的质量控制措施，提升人员检测能力，优化试剂、设备、样本、环境的管理，加强对检测方法执行的过程控制，从而充分保证所出具检测结果的有效性和可信度，使这种新兴的检测手段得到更有效、更长足的发展利用。