DIS3基因在肿瘤中的研究进展

魏 堯,解春宝,蒋灵晰,何阳军,石 毅△

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院,人类疾病基因研究四川省重点实验室,四川 成都 610072;2.电子科技大学医学院,四川 成都 611731;3.西南医科大学医学检验系,四川 泸州 646000)

肿瘤是人类健康的威胁之一,它会造成正常组织器官结构和功能的破坏,严重的可导致死亡。有研究发现在多种肿瘤的发生发展中存在DIS3基因的异常表达。DIS3作为核糖核酸酶是外泌体复合物的催化亚基,包含外溶核(RNB)和内溶核(PIN)结构域,可以直接作用于大量不同RNA物种的加工、周转和监测[1],在多种肿瘤的发生发展中发挥作用,如在多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)中DIS3是最常见的突变基因之一、白血病的发生也与DIS3的突变和丢失有关、DIS3基因可以促进结肠癌的发生发展、DIS3基因在黑色素瘤的发展中也起着调控作用等。本文对DIS3在一些肿瘤的最新研究进行阐述,希望为肿瘤的治疗提供全新的研究方向与治疗靶点。

1 DIS3基因

DIS3基因是1988年发现于裂殖酵母中。Ohkura等[2]在有丝分裂时姐妹染色单体分离相关基因的研究中鉴定出DIS3基因。DIS3基因属于存在于从细菌到人类的大多数生物中的RNase II/RNR超家族。该基因位于人类染色体13号染色体的长臂2区1带(13q2.1),并广泛表达于人体各种组织中。

1.1 DIS3的结构域与蛋白结构RNA质量控制是保证转录完整的关键。辅助因子与适配体识别错误的RNA底物,并激活核糖核酸酶进行降解。真核生物的转录组主要受到核外泌体的调控,核外泌体是一种由9个亚基核心(EXOSC1-9)、分配性核糖核酸酶和DIS3蛋白(又称为Rrp44)三部分组成的环状结构,其中DIS3蛋白是一种高度保守的3’至5’外切核糖核酸酶,是外泌体的核心功能亚基,为外泌体提供催化活性。当RNA底物被识别后,RNA底物通常被引导通过9亚基外泌体桶状结构内的中心区域,随后被位于环基部的DIS3外切酶域降解。另外,一些特殊的RNA底物也能够被DIS3蛋白直接分解而不用进入桶状中心[3]。

人类基因组编码DIS3家族主要有三个成员:DIS3蛋白、DIS3L蛋白和DIS3L2蛋白(见图1)。DIS3家族蛋白通常含有一个RNB(RNA-Binding)结构域、两个冷休克结构域(CSD)、一个S1结构域(能够非特异性结合RNA)和一个PIN结构域。在N端,由三个半胱氨酸残基组成的CR3基序具有重要的结构作用(参与DIS3蛋白与外泌体结合)。CSD和S1结构域都有助于与RNA结合。PIN结构域和CR3基序相互作用使DIS3锚定于外泌体核心的底部[4]。

图1 DIS3基因基本结构与结构蛋白[3]

1.2 DIS3的蛋白功能DIS3蛋白作为可高效加工的水解酶,会优先选择5′端磷酸化的底物以3′到5′的方向水解单链RNA。DIS3蛋白具有两种不同的催化活性:内切酶活性(PIN结构域)和外切酶活性(RNB结构域)。PIN结构域采用RNase H(RNA酶H)的方式折叠,酶活性依赖于四个保守的酸性氨基酸(天冬氨酸)残基,它们与催化活性中心的两个镁离子共同发挥作用。外泌体中心通道的宽度仅够容纳单链RNA,因此PIN结构域不能切割双链RNA,但可以切割环状RNA和线性单链RNA。RNB结构域的外切酶活性位点位于中心通道的底部,只有至少7个核苷酸的单链RNA才能到达。靶向DIS3蛋白的底物既可以直接进入催化区域,也可以通过外泌体的中心通道进入底部的核糖核酸酶外切酶或内切酶位点[5]。只要在RNA的3′端存在至少4～5个核苷酸的非结构区,DIS3蛋白就可以通过分子内或分子间二级结构分解底物[6]。

DIS3主要功能是在RNA降解系统负向调控错误折叠蛋白的降解[7],除了RNA降解功能之外,DIS3基因还参与了稷酒裂殖酵母的着丝点组装,其作用是使中端染色质沉默[8]。目前已有的一些实验表明,抑制DIS3的活性会阻碍细胞的增殖和分裂。但存在个别反常影响,例如功能降低的DIS3蛋白可以促进小鼠B细胞的增殖[9]。总体而言,DIS3基因在RNA代谢中具有多种功能,包括mRNA质量控制、小RNA处理、染色体分离、细胞周期进展、纺锤体组装、甚至影响B细胞中抗体的多样性[3]。

研究发现,人类DIS3蛋白存在两种可变剪接的蛋白质编码异构体,体现在编码PIN结构域的序列不同,П亚型蛋白(ISO2)的PIN结构域比Ⅰ亚型蛋白短30个氨基酸。研究发现MM患者细胞及MM细胞株具有更高表达水平的DIS3亚型1蛋白(ISO1);慢性粒单核细胞白血病和急性髓系白血病患者样本以及健康捐赠者样本具有相似水平的ISO1和ISO2。两种亚型蛋白的异常表达均可以促进血液病癌症的进展[10]。见图2。

1.3 DIS3家族如上所述,DIS3酶是外泌体必不可少的催化亚基,DIS3家族的DIS3蛋白、DIS3L1蛋白和DIS3L2蛋白已被证实参与重要的细胞过程,例如调控有丝分裂。DIS3L1也与外泌体相关,定位于细胞质。值得注意的是,DIS3L2可以独立于外泌体发挥作用,并对尿苷化RNA表现出独特的倾向。

DIS3L2基因是稷酒裂殖酵母DIS3基因的一个同源基因。DIS3L2蛋白定位于细胞质,缺乏DIS3和DIS3L1中的PIN结构域和CR3基序,这两个都是与外泌体复合物相互作用所必需的(见图1)。DIS3L2蛋白是具有高度保守的核酸外切酶,其突变常导致人类过度生长、Perlman综合征和肾母细胞瘤[11]。生殖系统中的DIS3L2基因突变会导致Perlman综合征和肾母细胞瘤。Perlman综合征表现为先天性过度生长,是一种常染色体隐性遗传疾病,与肾母细胞瘤易感性有关。相关研究发现DIS3L2基因的过表达抑制了人类癌细胞株的生长,而下调DIS3L2基因的表达则促进了这些细胞的生长。此外DIS3L2基因突变还存在于散发性肾母细胞瘤中[12]。除了肾母细胞瘤,DIS3L2基因还能促进肝细胞癌的进展[13]。因此,该基因被认为可以作为是肿瘤血清学检测的指标之一。

2 DIS3基因与肿瘤

2.1 DIS3基因与MMMM是发病率仅次于恶性淋巴瘤的常见血液系统恶性疾病,常患病于中老年人群,且不同地区和不同人种之间发病率有很大差异。目前平均每年的确诊人数已超过14万人。虽然MM患者的5年生存率从1975年的28%提高到2012年的56%,但目前仍然缺乏相关的特效药[14],给我国患者造成了极大的经济负担。

MM的临床表现因人而异,这种差异很大程度上是由获得性遗传因素驱动,这些遗传因素使疾病永久存在并在MM发生发展过程中起重要作用。骨髓瘤细胞产生大量无功能的、完整的免疫球蛋白或不完整的免疫球蛋白,这些免疫球蛋白的积累以及异常单克隆浆细胞与骨髓微环境中其他细胞的相互作用会导致MM症状(CRAB症状)。CRAB症状包括血钙增高、肾功能损伤、贫血及骨病。MM最常见的治疗相关症状是疲劳、便秘、手足疼痛和刺痛。几乎所有MM患者都始于意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)。每年MGUS进展为活动性(症状性)MM的风险约1%～2%,20年进展为MM的风险约为18%[15]。MM的诊断包括血液检查、骨髓检查、影像学检查。其中血清蛋白电泳定量M蛋白、免疫固定电泳及骨髓活检是主要诊断手段,骨髓活检包括免疫组织化学、流式细胞术、FISH分析,根据不同检查结果可对MM进行分型进而实施个体化治疗[16]。根据影像学检测结果,可分为四种类型:弥漫性骨骼受累(骨髓瘤)、弥漫性骨骼骨量减少、孤立性病变(浆细胞瘤)和硬化性骨髓瘤。根据电泳结果中M蛋白类型分为:IgA型、IgG型、IgD型、IgE型、IgM型、不分泌型、轻链型以及双克隆型。还可根据M蛋白的轻链类型分为κ型和λ型。使用FISH探针可检测染色体重复、缺失和重排。根据FISH检测结果可将患者分为超二倍体亚型和缺失亚型。

MM目前虽无完全治愈的治疗方案,但随着技术水平不断进步,针对的诊断和治疗得到了很大的改善。其治疗方法包括嵌合抗原受体T淋巴细胞疗法(CAR-T)、自体造血干细胞移植(ASCT)、诱导治疗、MM的支持治疗、蛋白酶体抑制剂、免疫调节药物以及单克隆抗体疗法等[17,18]。针对MM的发病机制,较多的观点是免疫球蛋白重链位点的易位和带有奇数染色体的三体以及超二倍体突变。MM细胞其他染色体结构变异也被认为是MM发病的原因,包括缺失、重复、易位等。最常见的5种易位分别为t(11;14)、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)和t(6;14),分别出现在15%、12%、3%、2%和1%的样本中。最常见的缺失突变包括del(13q), del(14q), del(6q), del(1p)和del(17p)[19]。除染色体变异外,基因突变与MM发病率密切相关,经常突变的基因包括TP53(36%)、KRAS(22.1%)、NRAS(15.1%)、DIS3(8.1%)和TET2/FGFR3(5.8%),以及以前未在骨髓瘤中报道的多个突变[20]。DIS3基因在MM中有较高的突变率,可能在MM的发病、进展和预后中发挥重要作用。在国内外研究中,突变基因(如TP53、DIS3、FAM46C、KDM6B和EGR1)的数量与MM预后不良有关[21]。

在DIS3蛋白功能缺陷的B细胞中,免疫球蛋白重链位点完整性受到影响。在NDMM(新诊断MM)中DIS3基因突变的频率约为10%。DIS3基因突变主要发生在DIS3蛋白的活性区域,其中RNB结构域为主要突变结构域。DIS3基因突变常伴随13号染色体长臂缺失,且在72%的病例中与13号染色体的缺失相关。研究表明,DIS3基因突变可以通过与胞嘧啶核苷脱氨酶的相互作用,间接导致体细胞染色体定位错误,从而导致染色体易位[22]。在大多数个体中,骨髓瘤细胞包含一个DIS3的等位基因,该等位基因存在错义突变,并且DIS3的第二个等位基因因染色体13q区缺失而缺失[23]。所有MM特异性DIS3基因突变都是错义突变,这些突变主要集中在RNB域,且存在3个DIS3基因热点突变(D488, E665和R780)。国外研究分析了164例代表性患者纯化骨髓浆细胞的DIS3基因PIN结构域和RNB结构域,DIS3基因在MM中的突变率为18.5%,被鉴定的变异主要是定位于RNB域的错义突变。33例DIS3基因突变患者中有19例(57.6%)携带del(13q14),突变率在新诊断的MM患者中为18.5%[24]。

目前DIS3基因突变导致MM的机理尚未阐明,但国内外实验室就其研究结果提出了一些假设:①DIS3基因的失活突变可能会破坏着丝点的形成,通过对异染色质的影响,导致姐妹染色单体分离缺陷和非整倍体形成;②DIS3基因的失活突变可能与骨髓瘤细胞中其他基因的突变协同作用以增强细胞增殖;③DIS3基因的失活突变可能会提高骨髓瘤细胞中非编码RNA的调控水平,提高基因组突变频率[24]。DIS3基因突变降低核糖核酸酶外切酶活性,从而提高了骨髓瘤的增殖能力。此外的其他研究也探讨了可能的机制,DIS3基因过表达可显著降低人骨髓瘤细胞增殖能力,可能与增殖细胞核抗原(PCNA)表达降低密切相关[25]。DIS3蛋白缺失破坏了外泌体10亚基的正常核定位,使其不能与核质底物结合进而导致核内RNA堆积。国外已有的研究发现RNA外泌体相关基因RBM7、SKIV2L2和DIS3发生体细胞突变,其功能缺失会上调成熟端粒酶RNA水平。虽然没有携带端粒维持基因的体细胞突变,但29%有生殖系端粒维持缺陷,这也许是遗传物质不稳定的原因[26]。

2.2 DIS3基因与其他血液肿瘤急性髓系白血病是一种异质性的血液恶性肿瘤,其病理特征是造血干细胞分化阻断和克隆增殖。急性髓细胞白血病常见基因突变包括剪切子突变、抑癌基因突变、转录子突变。其中DIS3基因突变占比不大,其中错义突变占所有患者4%,并且突变位点都在RNB结构域[27]。慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种老年血液病,其特征是单克隆异常淋巴细胞进行性堆积。有研究发现,在CLL患者中,DIS3基因座13q22经常丢失[28]。

2.3 DIS3基因与结肠癌结肠癌是全球常见的消化系统癌症之一。在美国,结肠癌的发病率仅次于乳腺癌、肺癌和前列腺癌,死亡率仅次于肺癌。相关研究发现DIS3具备促进结肠癌的发生发展的作用。与腺瘤相比,结肠癌组织中DIS3基因表达显著升高,并通过DIS3基因的沉默抑制了结肠癌细胞的增殖,同时也可以降低HCT116(结肠癌细胞株)的迁移和侵袭能力。这种基因表达显著升高可以通过DIS3基因座13q22的扩增来解释,该基因座改变在结肠癌细胞株HCT116中经常出现[29]。刘伟等[30]发现通过下调DIS3L2表达可增强结直肠癌干细胞的特性。国外研究发现DIS3基因在结直肠癌和肝转移患者的表达与腺瘤相比高38倍[31]。

2.4 DIS3基因与黑色素瘤黑色素瘤皮肤癌源于皮肤黑色素细胞,是具备高转移性质的肿瘤之一。不同的DIS3基因调控可能是浅表扩张性黑色素瘤(SSM)和结节性黑色素瘤(NM)不同临床表现的一个原因[32]。在SSM细胞中,DIS3基因的表达下调,而在NM细胞中,DIS3基因表达上调(与正常黑素瘤细胞相比)。由于其与黑色素瘤的关系尚未明确,DIS3基因并未被鉴定为黑素瘤分子生物标志物[33]。

3 总结与展望

尽管DIS3基因已被发现与多种类型的癌症相关,包括结直肠癌、黑色素瘤和血液肿瘤,但DIS3是抑癌基因还是促癌基因,目前还没有共识。DIS3在不同肿瘤中呈现不同的差异表达,表明DIS3基因的作用可能在不同的组织和致癌环境中有所不同。相关肿瘤中,MM是DIS3相关性最高的肿瘤,多个位点突变均与MM发生发展相关,并在患者的长期随访结果中也表现出DIS3基因突变与不良结局的相关性。介于该基因与多种肿瘤均具备一定程度的相关性,因此,确定DIS3基因在肿瘤发生中的作用可能有助于开发新的治疗靶点。