顺铂耳毒性:毛细胞死亡的分子机制及潜在靶点

万应翠,万珮峰,柴人杰,付小龙,孙 锦

(1.山东第一医科大学,山东 济南 250117;2.山东大学,山东 青岛 266237;3.东南大学,江苏 南京 211189)

顺铂又名顺二氨基二氯铂,是第一代铂类抗肿瘤药物,被广泛用于治疗膀胱癌、肺癌、卵巢癌等其他实体癌。顺铂通过阻滞肿瘤细胞分裂和生长,诱导细胞死亡,缩小肿瘤细胞体积,从而达到抗肿瘤的效果[1]。然而,顺铂在治疗过程中也会引起肾功能不全、肝毒性、耳毒性等副作用[2]。其耳毒性主要是基于耳蜗的特殊结构(如血-迷路屏障)增加顺铂泵出的难度,导致顺铂容易积累在内耳毛细胞中[3],导致毛细胞死亡,继而出现听力损失。因此,本文对毛细胞的分子机制和潜在治疗靶点进行综述。

1 毛细胞的死亡方式

大量研究证实,顺铂诱导毛细胞的死亡方式主要包括:凋亡、焦亡、铁死亡(图1)。小鼠耳蜗外植体经顺铂处理后,毛细胞表现出大量的丢失以及TUNEL阳性信号的增加[4],这一结果证实了顺铂会诱导毛细胞的凋亡。此外,焦亡也参与了顺铂诱导的毛细胞死亡,研究发现,顺铂处理后,小鼠耳蜗毛细胞中的焦亡信号如GSDME、半胱天冬酶-3或NLRP3的表达显著升高[5, 6],同时,研究人员通过加入GSDME或半胱天冬酶-3的抑制剂后可以挽救顺铂诱导的毛细胞死亡和听力损失[7]。作为一种新兴的细胞死亡方式——铁死亡,近几年一直在肿瘤方面被广泛研究。同时,也有越来越多的研究表明铁死亡与顺铂耳毒性息息相关。Bing[8]等发现顺铂可诱导HEI-OC1细胞中4-HNE的表达水平显著升高和GPX4的表达降低。在小鼠模型中,同样也发现了顺铂处理后4-HNE的表达水平增高和GPX4的表达降低,并且使用铁死亡抑制剂Fer-1可减少毛细胞丢失和听力损失[8, 9]。

图1 顺铂诱导耳毒性的机制模式图

2 ROS参与顺铂诱导的耳毒性

目前的主流观点认为,顺铂诱导的耳毒性主要是由于活性氧(ROS)的过度积累导致的[10, 11]。ROS是正常氧代谢的副产物,是由氧化酶大量增加和抗氧化酶耗尽所产生的,这些氧化酶包括NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶和脂氧合酶[12],其中,NADPH氧化酶是ROS的主要来源[13]。在正常生理条件下,被外界刺激激活的NADPH氧化酶与胞质蛋白形成复合物,该复合物催化氧化剂反应,最终产生ROS[14]。ROS可以激活抗氧化酶,随后,ROS通过还原反应被还原为水和氧气,实现了胞质内的氧化还原平衡。在小鼠内耳毛细胞中,顺铂会导致抗氧化系统的失调,使得ROS的过量积累并引起DNA损伤,导致毛细胞丢失和听力损失[15]。研究发现,天然的强效抗氧化剂Avenanthramide-C(AVN-C)可以减少顺铂诱导的HEI-OC1细胞的死亡和ROS的产生[16];在顺铂诱导的小鼠损伤模型中,AVN-C减少了外毛细胞的丢失并降低了小鼠的ABR(听觉脑干反应)阈值。研究证实,在小鼠耳蜗外植体上,抗氧化剂呋喃硫胺的预处理可以减少ROS的过量积累并保护顺铂诱导的听力损失[17]。此外,二甲双胍也是一种常见的抗氧化剂,可以通过减少顺铂诱导ROS的积累来减少毛细胞死亡[18, 19]。因此,通过增强抗氧化系统减少ROS的过量积累可能成为治疗顺铂耳毒性的一个重要靶点。

3 顺铂诱导毛细胞发生凋亡

凋亡是细胞程序性死亡的一种方式,主要由半胱天冬酶通过外在或内在途径激活来调节的[20],见图2。外在途径是由靶细胞表面的死亡受体肿瘤坏死因子受体(TNFR)及相应的配体肿瘤坏死因子-α(TNF-α)相互作用触发的。当细胞处于氧化应激环境中,细胞膜表面的TNFR和TNF-α相结合,激活了半胱天冬酶8(Caspase-8)和半胱天冬酶10(Caspase-10),随后激活下游效应器半胱天冬酶3(Caspase-3)和半胱天冬酶7(Caspase-7),激活后的半胱天冬酶可降解细胞内的错误折叠或未折叠的蛋白,从而引起细胞凋亡[21]。内在途径主要由半胱天冬酶9(Caspase-9)引发,该途径受促凋亡因子(Bax、Bak等)和抗凋亡因子(Bcl-2、Bcl-xl等)之间相互平衡调节的。在氧化应激期间,细胞中的促凋亡因子和抗凋亡因子表达水平变化导致线粒体膜通透性改变,线粒体内的细胞色素C和ROS释放于细胞质中,随后游离的细胞色素C与凋亡酶激活因子-1结合形成凋亡小体,凋亡小体激活Caspase-9并且触发了细胞凋亡[22]。据报道,在HEI-OC1细胞和UB-OC1细胞[23]中发现,在顺铂诱导后Caspase-3和Caspase-9被大量激活,TUNEL阳性信号的明显增加,细胞出现凋亡。同时,使用Caspase-9的抑制剂z-LEHD-fmk和Caspase-3的抑制剂z-DEVD-fmk可预防毛细胞免受顺铂诱导的损伤[24]。最近研究表明,中药对顺铂相关的耳毒性也具有预防和治疗作用[25, 26],20 (S) -人参皂苷Rh1(Rh1)和5,7-二羟基-4-甲基香豆素(D4M)作为一种抗凋亡活性物质,它们可以减少顺铂诱导的小鼠耳蜗外植体的ROS积累和Caspase-3的表达,从而减少毛细胞的丢失,不同的是,Rh1是通过抑制MAPK通路的活性来减少顺铂诱导的毛细胞凋亡[27],而D4M是介导JNK/FoxO1途径来预防顺铂相关的耳毒性[28]。核因子E2相关因子2(Nrf2)可以保护细胞免受氧化应激影响。Zhang等[29]研究报道,在小鼠耳蜗外植体上,使用Nrf2的激活剂TBHQ可以减少Caspase-3的表达和TUNEL阳性信号的表达,同时,在C57BL/6野生小鼠模型中,顺铂治疗前用TBHQ预处理可以减少毛细胞的丢失,并且ABR阈值有所降低。综上所述,毛细胞的凋亡在顺铂诱导的听力损失中发挥着重要作用,抑制凋亡相关的信号通路可能成为顺铂耳毒性的潜在治疗靶点。

图2 细胞凋亡、焦亡、铁死亡机制图

4 顺铂诱导毛细胞发生焦亡

焦亡是由炎性小体激活的一种死亡方式,炎性小体的组装始于细胞溶质模式识别受体,它们能够识别病原体相关分子模式(PAMPs)和危险相关分子模式(DAMPs)[30]。细胞焦亡分为经典途径和非经典途径。经典途径(图2):当细胞处于应激环境下,PAMPs和DAMPs接受细胞内信号分子并和凋亡相关斑点样蛋白、半胱天冬酶1前体形成炎性小体,同时Caspase-1活化。活化的Caspase-1激活GSDMD,并使其通过形成非选择性孔来穿透细胞膜,进一步导致细胞裂解和死亡[31]。在非经典途径中,胞质脂多糖(LPS)激活Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11,然后切割GSDMD介导NLRP3炎性小体的组装,随后触发细胞焦亡[32]。焦亡是一种新发现的细胞死亡方式,自发现以来,焦亡在肿瘤方面被广泛研究。Badr[33]等通过腹腔注射顺铂后,大鼠肾组织中的NLPR3、Caspase-1以及GSDMD显著升高,细胞出现严重的焦亡并引起肾功能损伤,当使用N-乙酰半胱氨酸和绿原酸(都是具有抗炎作用)联合用药时,肾组织中的焦亡反应明显降低。此外,也有研究报道,顺铂可能通过NLRP3/Caspase-1/GSDMD途径诱导乳腺癌焦亡[34]。近期也有研究表明,焦亡在顺铂诱导的听力损失中也发挥重要作用。Li等[35]研究证实,在HEI-OC1细胞中,类黄酮化合物柚皮苷(Nar)与顺铂联合处理细胞时,通过实时定量PCR检测到Nar降低了NLPR3和Caspase-1的表达,并且减少了细胞焦亡。在顺铂诱导的小鼠模型中,毛细胞中的GSDME(gasdermin家族的另一种蛋白)、NLRP3以及白细胞介素(IL)-1β、IL-18、IL-6的表达水平显著升高,小鼠听力受损[5]。冬凌草素(Ori)是NLRP3的抑制剂,最近有研究报道,Ori可以通过抑制NLRP3炎症小体活化和Caspase-1/GSDMD相关的毛细胞的焦亡来挽救卡那霉素诱导的听力损失[36],或许,Ori可能也会预防或缓解顺铂诱导的听力损失。应进一步研究抗炎症因子或抗焦亡相关蛋白,以减轻顺铂诱导的听力损失。

5 顺铂诱导毛细胞发生铁死亡

铁死亡主要受铁稳态和氧化应激的通路调节,其主要的两个生化特征就是铁积累和脂质过氧化[37](图2)。铁是一种必需元素,但铁的过量积累会导致细胞出现死亡,当机体内的铁代谢(包括其吸收、储存、利用和消耗)出现异常时,细胞内游离的铁离子浓度就会增加,脂质过氧化水平升高,从而诱导细胞发生铁死亡[38]。经典的铁死亡诱导剂erastin就是通过增加细胞内铁的积累导致细胞死亡[39]。在铁死亡的过程中,脂质过氧化与谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)密切相关,GPX4是一种谷胱甘肽和硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶,可以抑制铁死亡过程中形成的脂质过氧化物。谷胱甘肽由胱氨酸调控,当胱氨酸匮乏时,谷胱甘肽的合成受到影响,继而减少了GPX4的表达水平,从而使细胞发生铁死亡[40]。铁死亡的调节还涉及了其他的途径,如甲羟戊酸通路[41]、P53(肿瘤抑制蛋白)通路[42]等。作为一种新兴的细胞死亡方式,铁死亡具有区别于其他死亡方式的明显特征,包括线粒体体积变小、嵴减少、线粒体膜破裂,但是细胞核正常[43]。铁死亡在肿瘤治疗中发挥着重要作用,一些证据表明铁死亡与许多病理之间存在密切的联系,铁死亡被广泛认为是一种肿瘤抑制机制,铁死亡诱导剂二氢青蒿素强烈增强顺铂对胰腺导管腺癌细胞的细胞毒性[44]。近几年也有研究表明,铁死亡在顺铂诱导的听力损失过程中也发挥着关键作用。Mei等[45]建立了体外模拟顺铂诱导听力损伤的模型,在HEI-OC1细胞以及小鼠耳蜗外植体中,用铁死亡的抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)预处理后,可以降低顺铂诱导的Fe2+和脂质ROS的积累以及线粒体的损伤,减少顺铂诱导的毛细胞丢失。Fer-1也减轻了斑马鱼毛细胞中的顺铂毒性[8]。同时也有研究表明,增强GPX4等各种抗氧化酶的活性,可能减少顺铂诱导的毛细胞损伤[8, 46]。可见通过减少铁积累和脂质过氧化可能使毛细胞免受顺铂诱导的铁死亡,减少听力损失。

6 小结与展望

顺铂是临床一线抗肿瘤药物,但严重的副作用限制了其使用,其中包括耳毒性。顺铂主要通过诱导毛细胞死亡从而引发听力损失,虽然许多研究者已经开展了较多顺铂诱导毛细胞死亡的相关研究,但是其机制仍不太清楚,如何预防、减缓和治疗听力损失有待进一步探索和研究。凋亡、焦亡和铁死亡是顺铂治疗过程中主要的毛细胞死亡方式,目前已有研究证实抑制毛细胞的凋亡、焦亡和铁死亡可能减少听力损失,但对其防治听力损失的确切作用尚不清楚,因此需要更多的研究来评估顺铂诱导毛细胞死亡的分子机制和潜在的治疗靶点。