低产高级醇桑葚酒发酵工艺优化

廉苇佳，雷 静，韩 琛，刘志刚，苏含明，阿依加马丽·加帕尔，陈 雅

（新疆农业科学院 吐鲁番农业科学研究所，新疆 吐鲁番 838000）

0 引言

桑葚为桑科落叶乔木植物桑(MorusalbaL.)的果穗［1］，含有丰富的多糖、酸、氨基酸、维生素、微量元素和矿物质，被医学界誉为“21世纪的最佳保健果品”［2］，具有清除自由基、调节机体免疫功能、降血脂、抗诱变等作用［3］。桑葚酒是以桑葚为原料经酵母菌发酵而成的果酒，市场上销售的桑葚酒多为配制酒，发酵酒极少，存在饮后打头、头晕、头痛等问题，桑葚酒中高级醇含量过高是导致容易“上头”的主要原因之一［4］。

高级醇指3个碳以上的一元醇类物质的总称，其主要成分为戊醇、异戊醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、苯乙醇等［5-7］。高级醇是桑葚酒发酵过程中酵母代谢的副产物，是果酒重要的质量指标［8-9］，也是酒的主要香气成分、风味物质之一。如果高级醇含量很低则酒的风味单薄，当含量适中时能使酒体丰满、口感协调［10］。在陈酿、贮藏过程中，高级醇能够转化变成酯类，从而使酒体呈现特殊的陈香，给人以醇厚的感觉［11］。然而，当高级醇含量过高时，不仅会对人体产生不良的副作用，还会将异味带入酒体而影响风味［12-13］。高级醇的毒性随分子量的增大而增加，且高级醇的中毒和麻醉作用比酒精强［14-15］。据Rappa等［16］报道，当葡萄酒中高级醇总量达到300 mg/L 时，可产生愉快的风味，但当高级醇总量达到400 mg/L 时，则会产生刺激性的口感。含量过高会使酒的风味不协调，苦、涩味增加，饮后易出现神经系统充血，进而引起剧烈的头晕、头痛等症状［12，17-18］，就是所谓的“上头”，严重时对人体有毒害作用，因此，控制酒中高级醇的含量在适宜的浓度具有重要意义。

发酵因素对酵母菌细胞的生长代谢和发酵产物的积累具有重要影响，发酵条件直接影响着发酵产物的生成量［19-20］，因此可以通过调节桑葚酒发酵条件调控高级醇生成量。酵母菌种［21］、酵母接种量［22-23］、发酵温度［24-25］、发酵醪液初始pH值［26］、发酵醪液糖度［25］等因素的改变都会导致酵母的代谢途径和次级代谢产物的生成量发生变化［27-28］。发酵因素对高级醇形成的影响在啤酒、白酒、葡萄酒、白兰地中已经开展相关研究，但是其具体代谢途径调控机理尚不明确。酿造过程中发酵因素对高级醇生成量的影响逐渐受到学者们的高度重视，然而不同发酵因素对高级醇生成量的影响效果不一。本研究通过优化发酵条件来控制桑葚酒中高级醇的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂 试验材料鲜黑桑葚于2022年5月购自新疆吐鲁番市高昌区；酿酒高活性干酵母(LALVIN DV10)购自上海杰兔工贸有限公司；焦亚硫酸钾（食品级）购自新疆顶峰进出口有限公司；白砂糖购自新疆中唐糖业有限责任公司；果胶酶购自上海康禧食品饮业有限公司；正丁醇、正丙醇、仲丁醇、异丁醇、异戊醇、正戊醇、异戊醇、苯乙醇等色谱纯均购自上海安谱实验科技股份有限公司，异戊醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备 7890B型气相色谱仪购自安捷伦科技有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZT/H 打浆机购自乌鲁木齐市米东区东霸不锈钢食品机械配件经销部；TP-A500型电子分析天平购自美国康州HZ电子有限公司；TD型糖度计购自上海融测电子科技有限公司；PHB-3型pH计购自上海三信仪表厂。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程 桑葚酒发酵工艺流程为桑葚→选粒→榨汁→SO2处理→添加果胶酶→调整糖度、酸度→接种→发酵→分离→陈酿→过滤→杀菌→灌装。

1.2.2 操作要点 首先去除桑葚原料中的烂果、霉果以及树枝、树叶、石子等杂物，然后称取500 g桑葚，用打浆机榨汁，再分别加入SO2（添加量0.03 g/kg)、果胶酶（添加量0.0225 g/kg)和酵母EC118，于20 ℃温度下进行发酵，在发酵期间2次加入适量白砂糖，并观察桑葚酒的发酵特性，发酵结束后测定相关指标。

1.2.3 单因素试验设计 桑葚酒的口感、风味、总高级醇含量等受到发酵温度、酵母接种量、初始糖度、初始pH值等多种因素的影响，因此，本试验选取酵母接种量、初始pH值、初始糖度和发酵温度4个因素进行单因素试验。

通过预试验，在酵母接种量为0.25 g/kg、pH值为3.5、发酵温度为22 ℃、初始糖度为22%的条件下，保持其他条件不变，只改变其中1个因素，以感官评分、总高级醇含量为指标，以发酵时间、酒精度、总糖和总酸为辅助指标，研究不同单因素对桑葚酒感官品质、总高级醇含量的影响。单因素试验设置酵母接种量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/kg，pH值分别为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，初始糖度分别为18%、20%、22%、24%、26%，发酵温度分别为18、20、22、24、26 ℃，

1.2.4 响应面试验设计 选取酵母接种量、初始pH值、初始糖度、发酵温度为主要影响因素，以高级醇含量作为响应值，进行响应面优化试验，各因素水平编码如表1所示。

表1 响应面试验因素水平和编码表

1.2.5 测定指标与方法

1.2.5.1 指标测定 使用折光糖度计测定初始糖度；依据《葡萄酒、果酒通用分析方法》(GB/T 15038—2006)［29］测定酒精度；参照《蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法》(GB/T 5009.48—2003)［30］中的气相色谱法测定高级醇含量；参照《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》(GB 12456—2021)［31］中的酸碱滴定法测定总酸含量；参照《食品安全国家标准食品中总糖的测定》(GB 5009.7—2016)［32］中的斐林试剂法测定总糖含量。

1.2.5.2 桑葚酒感官品质评定 参照T/CNFIA 104—2018［22］中桑葚（果）酒的品评标准，以外观、香气、滋味、典型性4个指标，对桑葚酒的感官品质进行综合评价，满分为100分。由10名专业品评人员组成品评小组，进行感官评定，去掉1个最高分和1个最低分后，取其平均分四舍五入取整数作为感官评分。桑葚酒感官品质评定标准如表2所示。

表2 桑葚酒感官品质评定标准

1.2.6 数据处理 本研究所有试验和指标测定均进行3次，结果以“平均值±标准差”表示。采用Excel 2007和SPSS 22.0软件对试验数据进行处理与回归分析；采用 Design Expert 8.0.6 软件进行作图和响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酵母不同接种量对桑葚酒品质的影响 由表3可以看出，随着酵母接种量的增大，桑葚酒发酵时间缩短，酒精度增大，总糖含量降低，这是因为酵母接种量越大，酵母繁殖越迅速，进而缩短了发酵时间，消耗了更多的糖用于产生酒精，导致发酵后桑葚酒中总糖含量降低。酵母接种量的增大对桑葚酒总酸含量的影响不显著。酵母接种量的增大对桑葚酒高级醇含量表现为先降低后升高的趋势。高级醇是酵母在发酵过程中合成细胞蛋白质的副产物，当接种量增大时，起初酵母增殖倍数小，合成的高级醇较少，随着酵母接种量的继续增大，酵母增殖倍数不再变化或者变化很小，合成的高级醇增加［33］。当酵母接种量为0.2和0.3 g/kg时，桑葚酒的风味口感最好，感官评分较高，分别为79.00、80.00分。

表3 酵母接种量对桑葚酒品质的影响

2.1.2 不同初始pH值对桑葚酒品质的影响 由表4可知，随着初始pH值的增大，酒精度呈现出明显的先升高后降低的趋势，因为酵母在适宜的pH值下才能充分活化，过高的初始pH值会抑制酵母活化，导致酒精度下降，较适宜的初始pH值为3.5时，此时产生的酒精度最高,为11.40，总糖含量最低，为12.40%；当初始pH值为3.0和3.5时，总酸含量较大，分别为8.90、8.40 g/L；初始pH值的增大对高级醇含量的影响不显著，但其值总体偏高；初始pH值的增大对感官评分的影响也不显著，当初始pH值为3.0和3.5时，感官评分较高，分别为85.00、86.00分。

表4 初始pH值对桑葚酒品质的影响

2.1.3 不同初始糖度对桑葚酒品质的影响 由表5可知，初始糖度的增加对桑葚酒发酵时间的影响明显，随着初始糖度的增大，发酵时间整体呈缩短的趋势。当初始糖度介于18%～24%时，对酒精度的影响显著，且其值逐渐增大；当初始糖度介于22%～26%时，酒精度增高的趋势变缓，同时在该范围内总糖含量增大趋势明显，说明初始糖度超过22%时，可能导致发酵液的糖度过高，究其原因一方面是酵母所需底物过剩，另一方面是糖度过大导致发酵液渗透压升高，进而抑制了酵母的活性，使发酵变缓，同时还会引起其他一些副反应，最终导致桑葚酒口感下降。不同初始糖度对总酸含量的影响不显著。当初始糖度介于18%～22%时，高级醇含量呈先升高后降低的趋势；当初始糖度介于22%～26%时，高级醇含量显著升高。随着初始糖度的增大，桑葚酒的醇厚味及口感逐渐变好然后下降，当初始糖度介于20%～24%时，桑葚酒的口感较醇厚绵长，感官评分较高。

表5 初始糖度对桑葚酒品质的影响

2.1.4 不同发酵温度对桑葚酒品质的影响 由表6可知，发酵温度越高，桑葚酒发酵时间越短，酒精度越高。当发酵温度在20～26 ℃时，酒精度均在10% vol以上，符合桑葚果酒酒精度的要求；当发酵温度在22、24 ℃时，桑葚酒中总糖含量较高，分别为23.50%、22.30%；随着发酵温度的升高，总酸含量变化不显著；随着发酵温度的升高，高级醇含量呈先降低后升高的趋势，当发酵温度在18～22℃时，高级醇含量较低；随着发酵温度的升高，桑葚酒的感官评分呈先升高后降低的趋势，当发酵温度在20～24 ℃时，桑葚酒口感、滋味、香气等指标均较好。

表6 发酵温度对桑葚酒品质的影响

2.2 响应面法优化桑葚酒发酵工艺

根据单因素试验结果，以桑葚酒中高级醇含量为响应值，选用酵母接种量、初始pH值、初始糖度和发酵温度4个因素进行4因素3水平Box-Behnken响应面优化试验。

2.2.1 模型的建立与分析 根据单因素试验结果，经Design Expert 8.0.6统计分析软件设计出的29个桑葚酒发酵工艺试验方案及结果如表7所示。

表7 响应面试验设计结果

利用Design Expert 8.0.6 统计软件对试验数据进行多元回归拟合，得到高级醇含量(Y)对自变量酵母接种量(A)、初始pH值(B)、初始糖度(C)、发酵温度(D)之间的二次多项回归模型为：

2.2.2 回归方程拟合及方差分析 由高级醇响应面回归模型方差分析（表8）可以看出：回归方程的模型拟合程度好，由这4个因素及其二次项能较好地预测试验结果。对于模型来说，F值为266.36，P＜0.0001，表示拟合获得的回归模型极显著，回归模型与实测值拟合程度好，可信度高，可用该回归方程替代试验真实点值对试验结果进行分析。失拟项的F值为1.37，P=0.4090(P＞0.05)，即失拟项不显著，说明该回归方程能够充分反映实际情况。模型的决定系数R2=0.9963，校正决定系数R2adj为0.9925，为总变异的1.53%，说明试验值与模型回归值一致性良好，该模型能够解释0.9925的响应值变化，试验误差较小，可以用此模型分析并预测桑葚酒发酵过程中高级醇的含量。上述回归方程各项方差分析结果表明：酵母接种量、初始糖度、发酵温度、酵母接种量与初始糖度的交互、初始pH值与发酵温度的交互、初始糖度与发酵温度的交互对桑葚酒高级醇含量的影响极显著；初始pH值对桑葚酒高级醇含量的影响不显著。C2和D2的P值均小于0.01，说明C2和D2对桑葚酒高级醇含量均有极显著的影响；初始pH值与初始糖度的交互和B2的P值均小于0.05，说明初始pH值与初始糖度的交互和B2对桑葚酒高级醇含量均有显著影响。

表8 高级醇含量回归模型方差分析及显著性检验

2.2.3 响应面分析 由图1和图2可以看出，各因素间交互作用的响应曲面图上均存在最优值，其中酵母接种量、初始糖度、发酵温度、酵母接种量与初始糖度交互、初始pH值与发酵温度交互、初始糖度与发酵温度交互的侧剖面图弧度比初始pH值的侧剖面弧度更大，说明酵母接种量、发酵温度和初始糖度对模型的影响比初始pH值大。由图1可知，初始糖度分别和酵母接种量、发酵温度的等高线图更接近于椭圆，且其响应面图陡峭，说明初始糖度与两者的交互作用极显著，桑葚酒高级醇含量随着初始糖度和酵母接种量的增加而增加，当高级醇含量达到极值后，又随着初始糖度和酵母接种量的增加而逐渐降低；初始pH值与发酵温度的等高线图也接近于椭圆，且其响应面图陡峭，初始糖度与发酵温度的交互作用极显著，桑葚酒高级醇含量随着初始pH值与发酵温度的增加而增加，当高级醇含量达到极值后，又随着初始pH值与发酵温度的增加而逐渐降低；初始pH值与初始糖度交互的等高线图接近于椭圆，其响应面图较陡峭，说明初始pH值与初始糖度的交互作用显著。由图2可知，6个响应面图中均存在响应值的最优值，所选择的试验范围属于极值附近的小范围，符合响应面适用条件，6个响应面图侧剖面的弧度显示酵母接种量、初始糖度和发酵温度的弧度均较大；酵母接种量和初始pH值、酵母接种量和发酵温度这2个交互作用的等高线图趋近圆形，说明其对桑葚酒高级醇含量模型的影响不大。

图1 各因素间的交互作用对桑葚酒高级醇含量影响的等高线图

图2 各因素间的交互作用对桑葚酒高级醇含量影响的响应曲面图

2.2.4 桑葚酒发酵最优工艺和验证试验 通过Box-Behnken试验，根据Design Expert 8.0.6.统计软件分析优化得到基于高级醇含量响应面模型的桑葚酒最佳发酵工艺为：酵母接种量0.21 g/kg，初始pH值3.07，初始糖度22.12%，发酵温度22.06 ℃，在该工艺条件下，桑葚酒高级醇含量为306.988 mg/L。结合实际条件，将发酵工艺条件调整为：酵母接种量0.2 g/kg，初始pH值3.1，初始糖度22%，发酵温度22 ℃，进行3次平行验证试验，得到桑葚酒高级醇含量为308 mg/L，与预测值的相对偏差在1%以内，表明本试验建立的响应面法优化模型能够很好地预测桑葚酒发酵的高级醇含量，本研究得到的工艺条件客观合理。

孙时光［4］采用单因素试验与L9(34)正交试验对桑葚果酒的发酵条件进行了优化，在初始糖浓度21°Brix、发酵温度25 ℃、酵母接种量7%的最佳发酵条件下，桑葚果酒高级醇含量较低，为 325.49 mg/L；罗惠波等［34］通过单因素试验和响应面试验调控了桑葚酒中高级醇的生成量，在初始pH值3.8、发酵温度24 ℃、酵母接种量8.0×106cell/mL的最佳工艺条件下，高级醇的生成量为357.06 mg/L，与常规发酵条件下的生成量相比降低了13.07 %；William等［35］采用Box-Behnken设计，研究了在发酵温度25 ℃、pH值4、接种量10%(v/v)和糖度26%的优化发酵条件下桑葚酒高级醇浓度为249.91 mg/L。本试验低产高级醇桑葚酒最佳发酵工艺与上述桑葚酒发酵工艺均不同，主要为地域、气候、土壤、环境、品种、桑葚原料蛋白质、糖类含量、代谢产物转化途径、工艺参数等的差异，且发酵所用酵母菌的种类和数量也不一样，进而导致在桑葚酒发酵过程中降低高级醇含量的工艺也不同。

3 结论

本研究采用以高级醇含量为响应值的响应曲面法优化了桑葚酒发酵的最优条件，结合实际条件并通过验证试验得到桑葚酒的最佳发酵工艺条件为：酵母接种量0.2 g/kg，初始pH值3.1，初始糖度22%，发酵温度22 ℃，在该条件下发酵桑葚酒的高级醇含量为308 mg/L，预测结果与验证结果相差0.33%，表明优化桑葚酒高级醇含量的数学模型建立成功，与常规发酵工艺相比，高级醇含量降低了31.55%。因此，将响应曲面法应用于优化桑葚酒调控高级醇最优发酵工艺条件，能够获得真实可靠的结果，可用于指导生产实践。