基于表型性状和SSR标记的江西地方山药种质遗传多样性分析

辛佳佳，汤 洁，张 洋，涂玉琴，戴兴临，张南峰，谷德平

（江西省农业科学院 作物研究所，江西 南昌 330200）

山药(Dioscorea polystachyaTurcz.)又名薯蓣，为薯蓣科薯蓣属1年或多年生草质藤本作物［1-3］，其地下茎块含丰富的淀粉、可溶性糖及蛋白质等营养成分，口感独特而深受很多消费者的喜爱，同时还具有健脾养胃、补气益肾等功效，是生活中常见的药、食两用植物资源［4］。随着人们生活水平的提高和对食品安全、营养的重视，消费者对山药产品的需求量逐渐增大，由此对山药的研究报道也日益增加。

江西是我国山药的主要产区之一，江西山药品种的品质优良，在国内外都享有盛誉。在江西省生产上推广应用的多为地方品种，随着农业种植结构的调整和育成品种的示范推广，民间蕴藏的极其丰富的山药地方品种资源面临着快速丢失的风险，导致其遗传背景变得越来越狭窄。山药长期的无性繁殖和种植户自留种导致品种混杂、退化严重且地方品种多样以及各品种之间的亲缘关系不清［5］。因此，开展山药种质资源抢救性收集、鉴定、评价和分析，对山药新品种的选育和山药产业的发展具有重要意义［6-7］。本研究基于31个表型性状和11个SSR分子标记，对江西地方山药种质资源进行了遗传多样性分析，以期为江西山药种质保存、品种鉴定、资源改良及拓宽山药育种遗传基础等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验选用的山药种质资源为“第三次全国农作物种质资源普调查与收集行动”项目中收集得到，主要是江西省所属市(县)的各地方农家种质资源，共计77份(表1)，其中脚板薯71份，泰和竹篙薯、广丰铁棍山药、乐安土淮山、南城山药、瑞昌山药、永丰山药各1份。

表1 品种名称及其来源

1.2 试验方法

1.2.1 表型性状的测定 山药种质采用常规栽培管理，田间性状记载按《山药种质资源描述规范和数据标准》［8］进行，对蔓盘绕习性、蔓数、茎粗、单株叶数、叶形、叶长、叶宽、叶厚、叶柄长、块茎类型、块茎表皮色、块茎肉色、茎长、茎宽、单株产量等31个表型性状进行测量和统计，每份材料选取5株山药进行性状调查，其中数量性状取其平均值［9］。

质量性状赋值情况，蔓盘绕习性：1=逆时针，2=顺时针；叶密度：1=低，2=中，3=高；叶型：1=单叶，2=复叶；叶形：1=卵形，2=心形，3=剑形，4=戟形；叶耳间距：1=小，2=大；叶柄茸毛：1=无，2=有；卷须：1=无，2=有；叶翻卷：1=无，2=有；零余子：1=无，2=有；块茎类型：1=块状，2=根状；块茎紧密度：1=疏散独立，2=紧密独立，3=不独立；块茎形状：6=脚状，7=不规则，3=长卵；块茎分枝：1=分枝，0=不分枝；块茎根毛密度：1=少，2=多，3=中；块茎根毛分布：1=底部，3=上部，4=全部；块茎表皮褶皱：0=光滑，1=少皱，2=多皱；块茎表皮色：1=浅褐色，2=褐色，3=紫色；块茎肉色：1=乳白色，2=黄白色，3=浅紫色，4=紫色，5=紫白，6=红白；球茎有无：1=无，2=有。按上述赋值标准将数据记录在Excel表格中，利用SPSS 19.0软件计算各性状的平均值、标准差、变异系数、提取主成分及相关性数据。

1.2.2 基因组DNA的提取与SSR引物的扩增 采用CTAB法提取山药基因组DNA［10］，用紫外分光核酸测定仪检测所提取的DNA浓度与纯度，将浓度统一稀释到50 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存备用。从22对引物中筛选到11对条带清晰、稳定性好的引物(表2)，SY18参考Nemorin等［11］的文献记载，YM13、Da3G04、Dab2E07、Da1C12、Dpr3D06参考郭文等［12］的文献记载，SSR-1、SSR-17、SSR-41、SSR-53、SSR-92参考张文芳［13］的文献记载。PCR扩增总体积为10 μL，其中 2×Taq Mastermix 5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 3 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，最佳温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min，于4 ℃下保存。PCR扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，染色采用银染法［14］。选择条带清晰的PCR条带，人工读带，记录在Excel表格中，无条带记为“0”，有条带记为“1”，采用NTSYS 2.1软件分析了77个供试山药品种间的遗传相似性系数，利用UPGMA法［15］进行聚类分析，并用SHAN程序绘制树状图。

表2 SSR引物序列

2 结果与分析

2.1 山药种质资源表型性状的遗传多样性分析

2.1.1 山药种质资源表型的变异性和多样性指数分析 由表3、表4可知，供试山药种质资源的茎粗、叶长、叶宽、叶柄长、块茎长、单株产量的遗传多样性指数均较大，其中块茎宽的多样性指数最大，为2.04，块茎紧密度的多样性指数最低，为0.20。单株叶数的变异系数最大，为64.76%，其次是蔓数，变异系数为62.81%，茎粗的变异系数最小，为24.67%，这表明供试的77份山药种质资源拥有丰富的遗传多样性，具有很高的挖掘潜力。

表3 77份山药种质资源数量性状的多样性分析

表4 77份山药种质资源质量性状的描述及多样性指数

2.1.2 山药种质资源主要表型性状的相关性分析 通过对江西地方山药种质资源的31个表型性状间的相关性分析可知：山药的单株产量与节间长、叶长、叶宽、块茎长、块茎宽呈极显著正相关，与叶厚、叶柄长呈显著正相关；块茎宽与节间长、叶长、叶宽、叶柄长呈极显著正相关，与茎粗、叶厚、块茎长呈正相关，但相关性不显著；块茎长与节间长、茎粗、叶长、叶厚、叶柄长、块茎宽呈正相关，与叶宽呈负相关，但相关性均不显著；叶柄长与节间长、叶长、叶宽呈极显著正相关，与茎粗呈显著正相关，与叶厚呈负相关，但相关性不显著；叶厚与节间长、茎粗、叶宽呈负相关，与叶长呈正相关，但相关性均不显著；叶宽与节间长、叶长呈极显著正相关，与茎粗呈显著正相关；叶长与节间长、茎粗呈极显著正相关；单株叶数与节间长、茎粗呈正相关，但相关性不显著；节间长与茎粗呈极显著正相关(表5)。由此可知，山药叶片大且密、块茎宽和块茎长较大的品种对产量影响很大。

表5 山药数量性状间的相关系数

2.1.3 山药种质资源表型性状的聚类分析 山药种质资源的31个表型性状的聚类结果显示：在欧式距离=15处，77份山药种质资源被分为三大类群：类群Ⅰ包含63份材料，类群Ⅱ包含7份材料，类群Ⅲ包含7份材料。类群Ⅰ的特征是叶密度较低、叶片及块茎偏小、单株产量偏低；类群Ⅱ的特征是叶密度高，平均单株叶数高达872；类群Ⅲ的特征是叶密度适中、叶片及块茎大，单株产量高(表6、图1)。总体来看，类群Ⅰ可选出适合密植的小块茎材料；类群Ⅱ可选出高叶密度材料；类群Ⅲ中可选出大块茎的高产材料。

图1 基于表型性状的聚类树状图

表6 各类群主要质量性状的平均值

2.2 山药种质资源的SSR遗传多样性分析

2.2.1 SSR多态性分析 利用筛选的11对SSR引物对77份山药种质资源的DNA进行PCR扩增，结果显示：11对引物共扩增到113条清晰、可识别的条带，其中多态性条带93条，多态性占82.3%，每对引物扩增9～12个条带，扩增产物的片段范围大多集中在200～600 bp之间。Shannon’s I指数在0.094～0.489之间(表7)。总体上看，11对SSR引物的多态性较好，可用于供试材料的遗传多样性分析。

表7 11对SSR引物扩增的结果分析

2.2.2 SSR标记的聚类分析 在NTSYS软件中计算样品间的遗传相似性系数，并对 77份江西山药种质资源进行 UPGMA 聚类分析，结果显示(图2)：77份山药种质遗传相似性系数在0.398～1.000之间，其中，27与75的遗传相似性系数最小，为0.398，说明这2份种质资源的亲缘关系最远，1与13、50与52分别为同一品种，它们的遗传相似性系数为1，而6、7、35、43、59、61之间；3、37、45、53、55、67之间；4与56之间；8、22、29、30、49、52、57之间；28、58、69、76，34、36、38之间的相似性系数均为1，这可能是江西地方长期相互引种，或者地方种名称多样化导致的。

图2 基于SSR标记的聚类树状图

由图2可知，在相似性系数=0.5时，77份山药种质资源可以分为两大类群：类群Ⅰ包括71份材料，均为脚板薯；类群Ⅱ包括6份材料，分别为泰和竹篙薯、广丰铁棍山药、乐安土淮山、南城山药、瑞昌山药、永丰山药。其中广丰铁棍山药与乐安土淮山的遗传相似性系数最大，高达0.95，说明两者的亲缘关系很近。

3 小结与讨论

现代育种离不开丰富的种质资源，而地方品种经过长时间特定环境及农户的定向选择［16］，留下了很多优异品种。江西省拥有较为丰富的山药种质资源，收集这些品种资源并分析品种间的遗传特性，有利于充分利用这些品种资源进行遗传改良以满足不同育种目标的需求。此外，江西地方长期相互引种且地方种名称多样，导致市场上存在同物异名或同名异物的混乱现象［17］。因此，分析山药遗传多样性对山药引种改良、品种鉴定和生产加工等均具有重要意义［18］。

本研究对江西地方山药种质资源进行表型聚类分析，结果显示，77份材料可以分为三大类群，其中，类群Ⅲ的特点是叶大茎粗、叶密度适中、单株产量最高。相关性分析表明，单株产量与节间长、叶长、叶宽、块茎长、块茎宽呈极显著正相关。由此可推测，山药叶片的大小可能影响山药块茎的大小，进而影响其产量。因此，在选育高产山药品种的过程中，应关注对山药叶片和块茎大小的选育。

分子标记揭示的是材料间的内在遗传特性，其结果不受环境的影响，使得材料间的遗传关系能够被较好地反映出来［12］。本研究利用11对SSR引物对77份江西地方山药种质资源进行遗传多样性分析，得到其多态性为82.3%。聚类分析结果显示：圆柱形长棍山药单独聚为一个类群；另一大类群脚板薯的相似性系数均为1［17］。总体而言，江西地方山药种质资源的遗传多样性较为丰富，而江西地方脚板薯亲缘关系整体较近，遗传背景较为狭窄。

从前人的研究结果来看，基于表型性状的统计结果与基于分子标记的聚类分析结果不一致的情况在许多作物中均存在 ，如在辣椒［19］、梅花［20］、红三叶［21］、藜麦［22］和甘薯［23］等中均被报道过。这可能是分子标记结果反映的是基因组整体的相似情况，而植物的表型性状受控于个别基因且易受环境的影响，从而导致表型性状聚类与分子标记聚类结果存在偏差。