FAM84B抑制p53通路对食管鳞癌细胞增殖作用的影响

陈菲，张亚玲，王芳，李泓漪，周延，翁泳佳，程彩霞

1.山西医科大学，山西太原 030001；2.山西医科大学第一医院，山西太原 030001；3.山西医科大学转化医学中心，山西太原030010

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位于我国第三和第四［1］。食管癌组织学类型主要分为食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC），我国以ESCC 为主。目前ESCC 的主要治疗手段包括手术、化疗和放疗，其中放化疗效果显著，但仍有局限性，高等级发生率ESCC 患者5 年生存率仅10%［2］。目前，分子靶向治疗在多种实体肿瘤中治疗效果显著，也成为ESCC治疗的研究热点［3］。

研究显示，癌症通过获取体细胞遗传学改变，进而调控与细胞生长和凋亡相关基因的功能［4］。通过对这些癌基因和抑癌基因靶向改变的鉴定，使得对癌症发病机理的认知加速，特别是以体细胞拷贝数变异（somatic copy number variation，SCNV）为靶标的遗传学改变，其在肿瘤发生和癌症治疗中起核心作用［5］。SCNV具有使抑癌基因失活和活化癌基因的潜能，因此在癌症发生发展过程中发挥重要作用［6-7］。

本实验前期对104 份ESCC 患者肿瘤样本进行了14对全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）和90 对外显子测序（whole exome sequencing，WES），并运用GISTIC 2.0 软件对14 例WGS 分析SCNV，发现126个显著改变区域，包括8q24.13-8q24.21，FAM84B包含其中。在104份样本中，46份FAM84B基因发生拷贝数扩增，已经过荧光原位杂交试验（fluorescence in situ hybridization，FISH）验证这一结果；59份FAM84B显著高表达。提示FAM84B的扩增及其蛋白表达水平的升高与ESCC进展有关，FAM84B可能是ESCC易感性的潜在诊断标志［8］。FAM84B也称LRATD2，位于染色体8q24.21，在其他癌症中已证实该区域染色体扩增［9］。一些研究显示，FAM84B基因拷贝数扩增与癌症发生密切相关：FAM84B在乳腺癌［10］、前列腺癌［11］、ESCC［8］中表达增高；此外，FAM84B在前列腺癌细胞中显著高表达促进细胞侵袭、裸鼠成瘤和肺转移［12］。但FAM84B的作用机制尚不清楚。本研究通过体外试验探索FAM84B基因在ESCC 中的表达及其生物学功能，及其对ESCC细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1细胞及质粒人ESCC细胞系KYSE150、KYSE450、TE-1 及食管上皮细胞系NE-3 购自ATCC，由山西医科大学转化医学研究中心样本库储存；质粒pCMV-3 × flag-FAM84B购自北京普尔普乐生物技术有限公司。

1.2主要试剂及仪器FAM84B小干扰试剂、riboFECTTMCPReagent 转染试剂购自广东锐博生物科技有限公司；RPMI1640 培养基、0.25%胰酶、胎牛血清购自美国Hyclone 公司；MTT、二甲基亚砜和optiMEM购自美国Sigma 公司；Lipo2000 转染试剂购自美国Invitrogen公司；兔抗人FAM84B、CDK4、CDK6、CCND1多克隆抗体购自美国Abcam 公司；鼠抗人GAPDH、p53、p21 多克隆抗体购自武汉三鹰生物科技有限公司；IRDye®800CW 荧光二抗购自美国LICOR 公司；逆转录试剂、SYBRgreen、Stepone plus PCR 仪购自日本TaKaRa公司；96、6孔细胞培养板购自美国康宁公司；酶标仪购自美国BioTek公司；实时荧光PCR仪和定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3临床样本 508份ESCC肿瘤样本及其邻近正常组织收集自中国食管癌高发区山西省肿瘤医院和新疆医科大学附属肿瘤医院。本研究获得山西医科大学机构审查委员会和研究委员会批准，并获得所有参与者书面同意。508 对肿瘤和正常组织样本由2名病理学家独立使用苏木精和伊红（H＆E）染色诊断为ESCC。508 名ESCC 患者的医疗记录和生存数据均已获得。

1.4SCNV 分析及数据库查询 用BIC-seq253鉴定ESCC中SCNV；GISTIC 2.05识别复发性臂级和局灶性SCNA 节段；癌症基因组图谱（the cancer genomeatlas，TCGA）数据库或其他癌症基因组数据库的cBiobrowser分析ESCC中FAM84B扩增情况。

1.5细胞培养 用含10%胎牛血清和1%双抗的RMPI-1640 培养基于37 ℃，5% CO2培养箱培养KYSE150、KYSE450、TE-1、NE-3细胞，细胞融合度为85%～95%时传代，0.25%胰酶消化，收集生长状态良好的细胞进行后续试验。

1.6小干扰RNA转染 将细胞以3×105个／孔接种6 cm培养皿中，每孔培养液最终体积为3 mL，细胞密度达30%～50%时进行转染，设150-NC（未转染组）和FAM84B-Si1 和FAM84B-Si2 转染组。将1 × ribo-FECTTMCPBuffer 240 µL、20 µmol／L siRNA 储存液10 µL、riboFECTTMCPReagent 转染试剂20 µL 混匀，室温静置15 min 后加入6 cm 培养皿，48 ～72 h 后收集细胞，实时荧光定量PCR法检测转染效率。siRNA序列分别为：5'-CCCGCACTGGGCCGTATAT-3'和5'-CCTACCGGCTGCAGATTCA-3'。

1.7质粒转染 将细胞接种至10 cm 培养皿中，每个培养皿中培养液最终体积为8 mL。设450-NC（未转染组）和FAM84B-EXP 转染组。将1 mL optiMEM 与24µL Lipo2000 混匀，制成A 液，将1 mL optiMEM 与24 µg 质粒pCMV-3 × flag-FAM84B混匀，制成B 液；将A液室温孵育5 min后加入B液混匀，静置15 ～20 min；将混合液加入10 cm培养皿中，4 ～6 h后换成无双抗安全培养基，48 h后收集细胞沉淀，Western blot 法检测转染效率。

1.8实时荧光定量PCR 法 用Trizol 和氯仿法提取细胞总RNA，逆转录后，用Stepone plus PCR仪和SYBRgreen 进行实时荧光定量PCR 反应。根据GenBank中登录的FAM84B序列（NC_000008.11）及Primer Premier 5 软件设计特异性扩增引物。FAM84B（前链）：5'-ACCCACCTAAGTTACAAGGAAG-3'，FAM84B（后链）：5'-GTAGAACACGGAGCATTCCAC-3'；GAPDH（前链）：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，GAPDH（后链）：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。引物由Thermo公司合成。反应体系为：ddH2O 10.5µL，cDNA模板1µL，ROX 0.5µL，MIX酶12.5µL，上、下游引物各1µL。反转录反应条件：37 ℃15 min；85 ℃5 s；4 ℃+∝。qPCR 反应条件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 个循环；95 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃15 s。所有样本重复检测3 次。利用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.9Western blot 法 将细胞收集至1.5 mL 离心管中，用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液冰上溶解1 h；4 ℃，12 000×g离心30 min，BCA 法测定蛋白浓度。取50 µg，经10% SDS-PAGE 分离后，4 ℃，300 mA 转膜2 h；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；分别加入兔抗人FAM84B、CDK4、CDK6、CCND1 多克隆抗体和鼠抗人GAPDH、p53、p21多克隆抗体（均1∶500稀释），4 ℃过夜；加入IRDye®800CW 荧光二抗（1∶1 000稀释），室温避光孵育2 h。使用Image J软件分析图像，以目的条带和GAPDH 条带灰度分析值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.10MTT 试验 将细胞以5 000 个／孔接种96 孔板，设5 ～7 个复孔，每孔培养液终体积为200 µL，37 ℃，5%CO2培养箱分别培养24、48、72、96 h 后，弃培养液，加入5 mg／mL MTT，20 µL／孔，37 ℃恒温培养4 h；弃培养液，加入DMSO，200 µL／孔，孵育10 min；上酶标仪检测A600。

1.11硬克隆形成试验 将细胞以500 个／孔接种6孔板，每孔培养液终体积为2 mL，37 ℃，5%CO2培养箱培养10 ～14 d；PBS 洗涤2 次，4%多聚甲醛固定30 min；0.5%结晶紫染色25 ～30 min；显微镜下＞50个细胞为可计数克隆。

1.12统计学分析 采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析。呈正态分布计量资料的比较采用t检验和单因素方差分析，非正态分布计量资料的比较采用秩和检验。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1FAM84B基因在ESCC中拷贝数 扩增结果显示，FAM84B存在于8q24.21附近，并且存在1个显著放大的病灶峰（q=4.37 E-28），在508 份肿瘤组织中发现109份FAM84B基因拷贝数扩增（21.45%）。FAM84B基因拷贝数扩增比例为23.9%（23／96），高于其他癌种。见图1。表明FAM84B基因在ESCC 中存在显著拷贝数扩增现象。

图1 GISTIC 2.0软件对ESCC队列SCNV变化的分析Fig.1 Analysis of SCNV changes of ESCC cohort by GISTIC 2.0 software

2.2ESCC 细胞中FAM84B敲低和过表达效率验证在NE-3、KYSE150、TE-1、KYSE450细胞中，KYSE150和TE-1 细胞FAM84BmRNA 水平较高，见图2A。与150-NC 组相比，FAM84B-Si1 和FAM84B-Si2 组敲低效率分别为（57.65±20.06）%和（68.10±1.05）%（F分别为6.334、7.156，P均＜0.01），见图2B；FAM84BEXP 组的过表达效率为（65.22±7.07）%，与450-NC组相比差异有统计学意义（F=4.131，P＜0.05），见图2C。

图2 ESCC细胞系中FAM84B表达水平Fig.2 Expression level of FAM84B in ESCC cell line

2.3敲低FAM84B对ESCC细胞增殖的抑制作用 MTT试验结果显示，在KYSE150 细胞中，敲低FAM84B表达后，细胞增殖能力降低，见图3A。平板克隆形成试验结果显示，在KYSE150 细胞中，与150-NC 组克隆数［（172±10）个］相比，FAM84B-Si1、FAM84B-Si2 组克隆数［（46±3）和（47±5）个］减少，差异有统计学意义（F分别为6.451、6.122，P均＜0.01），见图3B、3C。表明FAM84B促进KYSE150细胞增殖。

图3 敲低FAM84B ESCC细胞系KYSE150细胞的增殖变化情况Fig.3 Proliferation changes of ESCC cell line KYSE150 with knockdown of FAM84B

2.4过表达FAM84B对ESCC 细胞增殖的促进作用MTT试验结果显示，在KYSE450细胞中，过表达FAM84B后，细胞增殖能力增强，见图4A。平板克隆形成试验结果显示，在KYSE450 细胞中，与450-NC 组克隆数［（75 ± 7）个］相比，过表达FAM84B后，FAM84BEXP 组克隆数［（163±10）个］增多，差异有统计学意义（F=5.634，P＜0.01），见图4B。表明FAM84B促进KYSE450细胞增殖。

图4 过表达FAM84B ESCC细胞系KYSE450的增殖变化情况Fig.4 Proliferation changes of ESCC cell line KYSE150 with overexpression of FAM84B

续图4 过表达FAM84B ESCC细胞系KYSE450的增殖变化情况Fig.4（Continued）Proliferation changes of ESCC cell line KYSE150 with overexpression of FAM84B

2.5敲低FAM84B对p53介导的细胞周期的促进作用与150-NC组相比，FAM84B-Si1和FAM84B-Si2组、p53、p21表达升高，CDK4、CDK6、CCND1表达降低，见图5。表明FAM84B可能通过调节p53信号通路，影响CDK4／CDK6／CCND1复合物表达，进而影响细胞周期。

图5 Western blot 检测敲低FAM84B KYSE150 细胞系中蛋白表达情况Fig.5 Detection of protein expression in KYSE150 cell line with knockdown of FAM84B by Western blot

3 讨论

SCNV 是癌症中最重要的体细胞畸变之一，其在肿瘤发生和癌症治疗中起核心作用。其中，致癌基因激活通常是因为染色体拷贝数扩增，而肿瘤抑制基因失活通常由与突变相关的杂合性缺失或纯合性缺失引起。因此，SCNV 的研究在癌症的预后和治疗改善中起重要作用［5］。本研究对508份ESCC患者的石蜡组织进行WGS 和WES，发现FAM84B基因在ESCC中拷贝数扩增。在另一项小型队列研究中（n=59），发现39 例（66%）ESCC 患者中FAM84B 表达增加［13］。另外，FAM84B基因扩增及其在蛋白质水平表达升高也存在于临床前病变中［8，14］。其他肿瘤中也发现FAM84B基因上调，如前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤［15］，并证实与前列腺癌、乳腺癌和ESCC的不良预后有关。本研究敲低FAM84B后，ESCC 细胞系KYSE150的MTT和硬克隆形成试验结果显示，细胞增殖减慢；而过表达FAM84B后，ESCC 细胞系KYSE450 的MTT和硬克隆形成试验结果显示，细胞增殖加快。因此，FAM84B拷贝数扩增很可能与ESCC增殖有关。

P53是经典的肿瘤抑制蛋白，其在肿瘤生长过程中控制细胞周期、DNA复制和不受控制的细胞分裂［16］。其中，控制细胞周期是通过抑制细胞周期由G1 期向S 期转化，使细胞周期停滞来实现［17］。当p53 蛋白发生突变或聚集时会失去功能，导致肿瘤进展和生长［18］。p53 的一个广泛公认的转录靶标是p21，其充当各种p53功能的下游介质，如诱导细胞生长停滞和衰老［19］。已有研究显示，p53 在ESCC 的诊断和治疗中均是有效的分子靶标［20］。因此，本研究对FAM84B与p53之间的关系进行了探讨。结果显示，敲低FAM84B后，Western blot分析显示，p53、p21蛋白表达升高，而CDK4／CDK6／CCND1 复合物表达降低。在一项乳腺癌的的研究中也发现，用CDK4／6 抑制剂处理过的乳腺癌细胞系中，p21表达水平降低［21］。因此，FAM84B可能通过抑制p53进而促进ESCC细胞增殖。

本研究发现，FAM84B基因在ESCC 中拷贝数扩增，并且可能通过抑制p53介导的周期蛋白的合成，促进ESCC细胞在体外增殖。因此，FAM84B基因可能作为ESCC潜在的新治疗靶点，但FAM84B在肿瘤发生中的作用复杂，其在ESCC中的作用机制尚需进一步探讨。