长链非编码RNA MALAT1对甲状腺癌细胞生长和侵袭的影响及其作用机制

王瑾琳，郑晨，魏晓霞，高岚

1.河南省人民医院河南大学医学院，河南郑州 450000；2.河南省肿瘤医院，河南郑州450000

甲状腺癌是常见的内分泌性恶性肿瘤之一，近年，其发病率呈不断上升趋势。该病最常见的两种类型为甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡状癌，占甲状腺癌的90%以上，该病普遍预后良好，但仍有部分患者在10年内出现复发或远端转移［1-2］。

甲状腺癌的发生发展涉及多种生物学过程，包括复杂的分子交互网络和调控机制，其中非编码RNA在转录和翻译水平的调控中发挥重要作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一组长度超过200 个核苷酸的非蛋白编码RNA，在多种肿瘤中表达异常，参与调控肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭、凋亡等多个生物学过程。如BANCR、H19和LINC00312 等lncRNA 可通过激活生存转移信号ERK／MAKP／AKT 或结合并抑制miRNA 发挥对靶分子的调控作用，促进甲状腺癌细胞的增殖和迁移［3-4］。MALAT1也是一种lncRNA，有报道显示，其在甲状腺癌中呈高表达，与甲状腺癌的预后、恶性增殖和转移密切相关；miR-211-5p是一种miRNA，可能受lncRNA的调控，在甲状腺癌中表达水平下调，外源性过表达miR-211-5p后可有效抑制甲状腺癌细胞的增殖和转移［5-6］。上述结果表明，MALAT1可能成为甲状腺癌潜在的治疗靶点。本研究旨在检测lncRNAMALAT1对甲状腺癌细胞生长和侵袭的影响，并探讨其作用机制，以期为进一步明确lncRNA在甲状腺癌中的分子作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1样本 选择2019 年1 — 12 月于河南省肿瘤医院行甲状腺癌切除术的44 例患者，其中男性17 例，女性27 例，年龄为41～63 岁。甲状腺乳头状癌35例，甲状腺滤泡状癌9 例。所有患者均签署知情同意书，术前未采用放化疗等方法进行治疗。手术切除癌组织及癌旁组织样本（编号1～44），经液氮瞬冷后置-80 ℃保存。本研究取得河南省肿瘤医院伦理学委员会批准。

1.2细胞、质粒及基因序列 人甲状腺癌细胞系SW1736、TC-1 和Hth7 均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；人甲状腺正常滤泡上皮细胞株Nthy-ori 3-1购自ATCC；质粒pcDNA3.1-MALAT1及pcDNA3.1均购自美国赛默飞公司；阴性对照序列si-NC（正义：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'，反义：5'-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3'）、MALAT1干扰序列si-MALAT1（靶向NR_002819.4的3 006 ～3 030 区域，正义：5'- CACAGGGAAAGCGAGTGGTTGGTAA-3'，反义：5'-TTACCAACCACTCGCTTTCCCTGTG-3'）、miR-211-5p过表达序列miR-211-5p mimics（5'-UUCCCUUUGUCAUCCUUCGCCU-3'）、乱序对照序列Scramble（5'-CCACUGUCCUGAAGUGAGAAA-3'）均由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.3主要试剂及仪器 RPMI1640培养基、胎牛血清、PBS 和胰蛋白酶均购自美国Gibco 公司；MTT 购自美国Promega 公司；TRizol 及LipofectamineTM2000 均购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒SYBR primeScript及定量PCR试剂盒SYBR GreenMix均购自日本TaKaRa公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.4甲状腺癌中MALAT1及miR-211-5p基因相对表达水平的检测 根据GenBank 中登录的MALAT1（378938）、miR-211-5p（406993）及U6基因（26827）序列，应用Primer Premier 6.0 软件设计引物，MALAT1上游引物：5'-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3'，下游引物：5'-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3'；miR-211-5p上游引物：5'-GCGCTTGTCATCCTTCGCCT-3'，下游引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物均由上海吉玛制药技术有限公司合成。将甲状腺癌组织及癌旁组织样本剪碎，置冰上研磨为匀浆，TRizol 试剂提取总RNA，SYBR primeScript 试剂盒逆转录为cDNA，以其为模板，进行PCR扩增。PCR扩增条件为：95 ℃预变性60 s；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环。以U6为内参，采用2△△CT法计算MALAT1及miR-211-5p基因的相对表达水平，并评价MALAT1和miR-211-5p在甲状腺癌组织中的表达相关性。

1.5甲状腺细胞系中MALAT1基因相对表达水平的检测 将SW1736、TC1 和Hth7 及Nthy-ori 3-1 细胞采用含10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI1640培养基，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养至对数生长期，检测各细胞中MALAT1基因的相对表达水平，方法同1.4项。

1.6MALAT1对甲状腺癌细胞生长能力影响的检测采用MTT 法。按1.5 项方法将SW1736 细胞培养至对数生长期，在LipofectamineTM2000的介导下分别转染pcDNA3.1-MALAT1、pcDNA3.1、si-MALAT1及si-NC，37 ℃转染6 h；将SW1736 细胞按2×103个／孔的密度接种至96孔板，37 ℃贴壁培养0、24、48和72 h；加入5 mg／mL 的MTT，20µL／孔，37 ℃孵育4 h；加入DMSO 溶液，用酶标仪检测A450。每组至少设3 个复孔，同时设空白对照（未加细胞），计算结果时需减去空白对照，去除背景干扰。

1.7过表达miR-211-5p对MALAT1诱导甲状腺癌细胞高生长能力影响的检测 按1.5项方法将SW1736细胞培养至对数生长期，在LipofectamineTM2000的介导下分别转染pcDNA3.1-MALAT1、miR-211-5pmimics、Scramble及pcDNA3.1-MALAT1+miR-211-5pmimics，37 ℃转染6 h；将转染细胞按2×103个／孔的密度接种至96 孔板，37 ℃贴壁培养0、24、48 和72 h，采用MTT法检测，检测过程同1.6项。

1.8MALAT1对甲状腺癌细胞侵袭能力影响的检测采用Transwell 小室试验。按1.5 项方法将SW1736细胞培养至对数生长期，在LipofectamineTM2000的介导下分别转染si-NC、si-MALAT1、pcDNA3.1、pcDNAMALAT1、miR-211-5pmimics 及miR-211-5pmimics +pcDNA3.1-MALAT1，37 ℃转染6 h；将转染细胞按2×105个／孔接种于24 孔板，加入无血清培养基，置Transwell 小室（8 µm）的上室，同时下室加入含10%FBS 的培养基作为趋化吸引物，37 ℃培育48 h；去上室未跨膜细胞，另一侧跨膜细胞用多聚甲醛固定10 min；PBS洗涤3次，用0.1%结晶紫染色，显微镜下观察细胞分布情况，随机选择10 个细胞均匀分布的区域进行拍照和计数。

1.9MALAT1对miR-211-3p表达调控作用的检测应用Starbase数据库中的lncRNA和miRNA相互作用数据库检索MALAT1与miR-211-3p之间可能存在的调控靶序列。同1.6 项获得转染pcDNA3.1-MALAT1、pcDNA3.1、si-MALAT1和si-NC 的SW1736细胞，检测miR-211-5p的表达水平，方法同1.4项，评价MALAT1对miR-211-3p表达的调控作用。

1.10统计学分析 应用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，GraphPad 8.0 软件绘图，计量资料以均值± 标准差（± s）表示，两组间比较采用独立t检验，多组间比较采用方差分析（One way ANOVA），事后检验采用LSD法，相关性分析采用Pearson相关分析，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1甲状腺癌中MALAT1和miR-211-5p基因的相对表达水平 与癌旁组织比较，甲状腺癌组织样本中MALAT1基因的相对表达水平明显增加（t=7.066，P＜0.001），miR-211-5p基因的相对表达水平明显下降（t=-8.889，P＜0.001），见图1；37 份癌组织样本中MALAT1基因相对表达水平上升（占84.1%），39份癌组织样本中miR-211-5p基因相对表达水平下降（占88.6%），见图2。甲状腺癌组织中MALAT1和miR-211-5p基因的相对表达水平呈显著负相关（r2为0.168，P=0.057），见图3。

图1 甲状腺癌组织和癌旁组织中MALAT1（A）及miR-211-5p基因（B）的相对表达水平Fig. 1 Relative expression levels of MALAT1 gene（A）and miR-211-5p gene（B）in thyroid cancer and adjacent tissues

图2 甲状腺癌组织中MALAT1（A）及miR-211-5p 基因（B）的表达水平Fig.2 Expression levels of MALAT1 gene（A）and miR-211-5p gene（B）in thyroid cancer tissues

图3 甲状腺癌组织中MALAT1与miR-211-5p基因相对表达水平的相关性Fig. 3 Correlation between relative expression levels of MALAT1 and miR-211-5p gene in thyroid cancer tissues

2.2甲状腺细胞系中MALAT1基因的相对表达水平Nthy-ori 3-1、SW1736、TC1 及Hth7 细胞中MALAT1基因的相对表达水平分别为1.01±0.02、2.76±0.29、2.05±0.31和2.58±0.03。与Nthy-ori 3-1细胞比较，SW1736、TC1、Hth7 细胞中MALAT1基因相对表达量分别增加（2.76±0.24）、（2.05±0.25）、（2.55±0.06）倍，且差异均有统计学意义（t分别为10.230、5.813、74.310，P分别为0.009、0.004、＜0.001）。

2.3MALAT1对甲状腺癌细胞生长能力的影响 与si-NC组比较，si-MALAT1组SW1736细胞的生长能力降低，转染72 h时差异有统计学意义（t=7.780，P=0.001）；pcDNA3.1-MALAT1组SW1736 细胞的生长能力升高，转染72 h 时差异有统计学意义（t= -7.410，P=0.002）。见图4。表明降低MALAT1表达可抑制甲状腺癌细胞SW1736的生长。

图4 过表达及抑制MALAT1 表达对甲状腺癌细胞生长能力的影响Fig. 4 Effects of overexpression and inhibition of MALAT1 expression on growth ability of thyroid cancer cells

2.4过表达miR-211-5p对MALAT1诱导甲状腺癌细胞高生长能力的影响 与Scramble组比较，miR-211-5pmimics组SW1736细胞生长能力下降，转染72 h时差异有统计学意义（t=-5.490，P=0.005）；与pcDNA3.1-MALAT1组比较，pcDNA3.1-MALAT1+miR-211-5pmimics组SW1736细胞生长能力下降，转染72 h时差异有统计学意义（t=-5.640，P=0.005），见图5。表明过表达miR-211-5p能够抑制MALAT1诱导的细胞增长。

图5 MTT 法检测过表达miR-211-5p 对MALAT1 诱导甲状腺癌细胞高生长能力的影响Fig. 5 MTT detectiob of effect of overexpression of miR-211-5p on growth ability of thyroid cancer cells induced by MALAT1

2.5MALAT1对甲状细胞腺癌侵袭能力的影响 si-NC、si-MALAT1、pcDNA3.1、pcDNA3.1-MALAT1、miR-211-5pmimics及miR-211-5pmimics+pcDNA3.1-MALAT1组SW1736 细胞发生侵袭的细胞数分别为（157.00 ±11.86）、（93.67±6.13）、（169.33±12.76）、（241.67±17.15）、（94.33±7.59）、（137.00±9.79）个。与si-NC组比较，si-MALAT1及miR-211-5pmimics组SW1736细胞发生侵袭的细胞数明显减少（t分别为-6.710 和-6.290，P均=0.003），pcDNA3.1-MALAT1组则明显增多（t=5.740，P=0.005）。见图6。表明miR-211-5p过表达能抑制MALAT1过表达引发的细胞转移的增加。

图6 Transwell小室试验检测MALAT1对甲状癌细胞侵袭能力的影响（×200）Fig. 6 Detection of effect of MALAT1 on invasionability of thyroid cancer cells by Transwell chamber assay（×200）

2.6MALAT1对miR-211-3p表达的调控作用MALAT1与miR-211-5p之间存在互补序列，见图7，表明MALAT1与miR-211-5p之间可能存在调控关系。pcDNA3.1、pcDNA3.1-MALAT1、si-NC、si-MALAT1组SW1736细胞中miR-211-5p基因相对表达水平分别为1.05±0.09、0.59±0.05、1.03±0.07、2.14±0.23。与pcDNA3.1组比较，pcDNA3.1-MALAT1组细胞中miR-211-5p基因相对表达水平明显降低（t=-7.510，P=0.002）；与si-NC 组比较，si-MALAT1组则明显增加（t= 7.960，P=0.001）。

图7 MALAT1和miR-211-5p基因序列互补对照图Fig.7 MALAT1 and miR-211-5p gene sequence complementary contrast chart

3 讨论

lncRNA 表达失调可影响细胞增殖、周期调控、凋亡、转移和化疗耐药等多种生物学过程。MALAT1位于染色体的11q13，是一种相对保守的lncRNA，在多种肿瘤中表达上调，如乳腺癌、骨肉瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌等［7-12］，其表达增加与肿瘤的转移、复发和预后差密切相关［13］。HUANG 等［5］发现，MALAT1在甲状腺癌中上调，通过诱导含IQ 基序的GTPase 激活蛋白（ras GTPase-activating-like protein，IQGAP）的表达增强肿瘤细胞的生长和转移能力。ZHANG等［14］通过RNA原位杂交法检测了良性、恶性甲状腺组织中MALAT1的表达情况，其中甲状腺乳头状瘤中随着良性向恶性发展，MALAT1的表达逐渐增加；作为诱发细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的主要驱动因子TGF-β 也促进了MALAT1的表达。在甲状腺滤泡状癌中，MALAT1的水平也明显高于癌旁组织，siRNA 干扰MALAT1表达后能有效抑制细胞的生长和转移［15］。WEN 等［16］对中国人群的甲状腺滤泡状癌患者的MALAT1基因多态性研究发现，MALAT1的基因多态性rs619586可降低甲状腺滤泡状癌的发病风险，体外功能试验显示，该单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）可降低MALAT1水平，增加肿瘤细胞的凋亡。本研究检测了44 份甲状腺癌及癌旁组织中MALAT1基因的相对表达水平，结果发现，在大多数样本中，MALAT1基因的相对表达呈上调趋势，siRNA靶向抑制MALAT1表达后可明显抑制SW1736细胞的生长和转移，表明MALAT1可能参与了甲状腺癌的发生、发展和转移。

MALAT1可能通过与内源性miRNA 结合的方式对下游信号和分子进行调控，从而参与细胞生长、凋亡和转移的过程。ZHUANG 等［17］研究发现，结肠癌中MALAT1能与抑癌性miR-106-5p结合，阻碍miR-106-5p对靶分子SNAIL2 的负性调控作用，促进结肠癌的侵袭和转移。WU等［18］报道表明，影响miR-194-5p与MALAT1发生相互作用的MALAT1rs664589 会增加结肠癌发生的风险，miR-194-5p与野生型MALAT1结合后能引发依赖Ago2 方式的MALAT1核内降解，MALAT1rs66489 破坏两者之间的结合，使MALAT1累积，引发不良事件。MALAT1还在恶性胶质瘤中充当miR-199a的“分子海绵”，阻碍miR-199靶向ZHX1转录抑制分子，下调促凋亡蛋白Bax 的表达，有利于肿瘤细胞的生存［19］。上述研究表明，在不同肿瘤中，过表达MALAT1可结合并通过调控miRNA与下游靶基因的方式，参与肿瘤多种恶性生物学行为。本研究发现，MALAT1和miR-211-5p基因相对表达水平在临床甲状腺癌样本中呈负相关（r2=0.168，P=0.005 7），MALAT1过表达能抑制miR-211-5p的表达，而上调miR-211-5p的表达，则可明显抑制MALAT1过表达导致的生长及侵袭优势，表明MALAT1在甲状腺癌中可能通过抑制miR-211-5p来发挥其生物学作用。miR-211参与乳腺癌、结肠癌、胃癌和卵巢癌等多种肿瘤发生发展的过程，肿瘤细胞中外源性表达miR-211-5p具有抗增殖和促凋亡能力［20-21］。miR-211-5p在不同肿瘤中可靶向多种分子和信号通路，如在三阴乳腺癌中，miR-211-5p直接靶向SETBP1，从而影响乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，且与患者的预后密切相关［22］；在膀胱癌中，miR-211-5p通过靶向抑制表观遗传学调控因子HDAC9的表达，从而影响肿瘤细胞的生长和转移［23］。WANG等［6］报道，miR-211-5p在肾细胞癌中能够靶向调控SNAIL1，抑制肾癌细胞的迁移能力。miR-211-5p可能参与了多个lncRNA的调控网络，肾癌中上调的lncRNA EGOT 通过“分子海绵”作用吸附miR-211-5p来减轻miR-211-5p对Erb-B2 受体酪氨酸激酶4（Erb-B2 receptor tyrosine kinase 4，ErbB4）的抑制，从而促进肾癌细胞的增殖和迁移［24］。LIANG等［25］研究发现，甲状腺乳头状癌中上调MCM3AP-AS1 能通过抑制miR-211-5p／SPARC 通路促进肿瘤细胞的生长和转移，沉默MCM3AP-AS1可使miR-211-5p上调而发挥抗肿瘤作用。TAN等［26］发现，LncRNAMALAT1可靶向减少miR-211-5p的表达，促进脑缺血再灌注情况下的神经元损伤，表明MALAT1与miR-211-5p之前存在潜在的调控关系。MALAT1与其他lncRNA 在甲状腺癌中相互作用的相关性尚未明确，它们可能受到上游的激活信号来共同靶向miR-211-5p，从而参与协调下游生长和转移的生物学作用，但需进一步深入研究确认。上述结果表明，miR-211-5p可能是甲状腺癌发生和转移过程中重要的调控分子，从该miRNA 入手设计靶向lncRNA 的药物可能为甲状腺癌治疗和预后评价提供新思路。

综上所述，甲状腺癌组织中MALAT1表达水平上调，miR-211-5p表达水平下调，两者表达呈负相关。MALAT1的过表达促进了甲状腺癌细胞的生长和转移，抑制MALAT1或过表达miR-211-5p则可明显抑制甲状腺癌细胞的增殖和侵袭。MALAT1能够调节miR-211-5p的表达，表明MALAT1／miR-211-5p可能作为甲状腺癌潜在的治疗靶点。