重组蛋白中甘氨酸、组氨酸含量柱前衍生反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

张小雪，梁舒静，王惠欣，王辉

华北制药集团新药研究开发有限责任公司抗体药物研制国家重点实验室，河北石家庄050015

氨基酸是常见的蛋白质保护剂之一，常用氨基酸类蛋白质保护剂有甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸、肌氨酸等［1-3］。本公司重组蛋白制品在制备过程中加入了适量的甘氨酸和组氨酸。低浓度甘氨酸降低了蛋白质药物变性的风险［4-5］，可预防重组人生长激素在冻干过程中聚集［6-8］。组氨酸为较常见赋形剂，其内部咪唑基团有助于发挥较好的pH 缓冲作用［9-11］。重组制品中的游离氨基酸含量对其质量控制具有重要意义［12-13］，《中国药典》三部（2020 版）生物制品生产用原材料及辅料质量控制的要求中，曾明确提出了生物制品生产企业用于生物制品注射剂生产的药用辅料应检测其含量［14-15］。本研究建立了重组蛋白制品中甘氨酸和组氨酸含量检测的柱前衍生反相高效液相色谱法（reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC），并对该方法进行验证。

1 材料与方法

1.1供试品及对照品 重组蛋白药物（批号：20211011）为本公司自制；α-氨基丁酸、甘氨酸、组氨酸购自美国Sigma 公司。

1.2主要试剂及仪器 乙腈（色谱纯）购自美国Honeywell 公司；AccQ·Fluor 氨基酸衍生试剂盒（waters WAT052880）、AccQ Tag Eluent A浓缩液（waters WAT-052890）、AccQ Tag氨基酸分析柱（3.9 mm×150 mm，4 µm，Waters WAT052885）、高效液相色谱仪（2695）均购自美国Waters 公司；紫外检测器（EVOLUTION 201）购自美国Thermo 公司；磺基水杨酸购自美国Sigma-Aldrich 公司；超滤离心管（UFC5010BK）购自美国Millipore公司。

1.3溶液配制

1.3.1流动相A 取200 mL AccQTag Eluent A 液（配方为：140 mmol／L乙酸钠，17 mmol／L三乙胺，1 mg／mL EDTA 二钠盐，0.5%NaN3，用浓磷酸调pH 至4.95 或5.05）与2 000 mL 超纯水混匀，经0.22µm 有机滤膜过滤，超声振荡5 min。

1.3.2流动相B 取乙腈1 000 mL，经0.22µm 有机滤膜过滤，超声振荡1 min。

1.3.3流动相C 取100%超纯水1 000 mL，超声振荡10 min。

1.3.41.5%磺基水杨酸 取磺基水杨酸1.5 g，加超纯水定容至100 mL，混匀。

1.3.5标准溶液

1.3.5.1α-氨基丁酸内标溶液取α-氨基丁酸40 mg，加超纯水定容至100 mL，混匀。

1.3.5.2甘氨酸标准溶液 取甘氨酸对照品375.5 mg，加超纯水定容至100 mL，混匀。

1.3.5.3组氨酸标准溶液 取组氨酸对照品375.5 mg，加超纯水定容至100 mL，混匀。

1.3.6AccQ·Fluor 衍生剂溶液 将AccQ·Fluor 衍生剂粉末轻弹至瓶底，加1 mL AccQ·Fluor稀释剂，振荡10 s，55 ℃加热9 min使粉末溶解。

1.4标准曲线样品、供试品、空白对照溶液的制备

1.4.1标准溶液 取甘氨酸标准溶液0.3 mL，用组氨酸标准溶液定容至10 mL，取0.9 mL，加1.5%磺基水杨酸8.1 mL，混匀，室温静置2 h；3 000×g离心10 min；分别取上清液0.2、0.4、0.6、0.7、0.8、1.0 mL，加超纯水定容至1 mL，混匀。

1.4.2供试品及空白对照品溶液 每个重组制品平行制备3份供试品。分别取供试品和超纯水0.1 mL，与0.9 mL 1.5%磺基水杨酸混匀，按1.4.1项静置离心后，取0.3 mL上清液与0.7 mL超纯水混匀。

1.5各溶液加内标溶液及衍生

1.5.1加内标溶液 分别取标准溶液、供试品溶液、空白对照品溶液各0.1 mL，加超纯水0.4 mL，与α-氨基丁酸内标溶液0.1 mL混匀。

1.5.2衍生 分别取标准溶液、供试品溶液、空白对照品溶液各10µL，加硼酸缓冲液70µL，涡旋混合，瞬时离心后在涡旋状态下加入AccQ·Fluor衍生剂溶液20µL，持续涡旋混合15 s。衍生后标准曲线中甘氨酸为2.25、4.51、6.76、7.89、9.01、11.27µg／mL，组氨酸为72.85、145.70、218.54、254.96、291.39、364.24µg／mL，即S1 ～S6溶液。

1.6检测方法 将S1 ～S6溶液、供试品溶液、空白对照品溶液按表1 试验条件进样分析。色谱条件：色谱柱为AccQ Tag-C18（3.9 mm × 150 mm，4 µm）；紫外检测波长为248 nm；柱温为37 ℃；上样体积为10µL。进样前用流动相A 平衡30 min，至基线平稳。按照空白对照、S1 ～S6、系统适用性（S3）、供试品溶液依次进样，以S3 为系统适用性样品，每3 ～6 个样品后加入1针系统适用性样品，依次循环。

表1 试验条件Tab.1 Experiment condition

1.7方法的验证

1.7.1专属性 取不含甘氨酸、组氨酸的空白制剂溶液，用空白制剂溶液超滤换液后的重组蛋白溶液，按1.5项方法加入内标溶液和衍生后，按1.6项方法检测甘氨酸、组氨酸与内标α-氨基丁酸的分离情况。

1.7.2线性 将S1 ～S6 溶液分别进样，以甘氨酸或组氨酸浓度为横坐标，甘氨酸或组氨酸峰面积／内标峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性相关系数（R2）。

1.7.3检测限 按1.5 项衍生后制备甘氨酸、组氨酸分别为1.13、36.43µg／mL的SL1溶液和甘氨酸、组氨酸分别为0.56、18.21µg／mL的SL2溶液，进样分析各样品信噪比。

1.7.4定量限 将组氨酸与甘氨酸对照品溶液按7∶1混合，平行制备6份。按1.5项衍生后制备甘氨酸、组氨酸分别为4.69、32.86µg／mL 的溶液，进样分析，计算甘氨酸或组氨酸峰面积／内标峰面积值的RSD。

1.7.5重复性 平行取6份重组蛋白制品（批号：2021-1011），按1.5和1.6项方法进行衍生和液相分析，每份样品进样1 次，检测甘氨酸或组氨酸含量，并计算其峰面积／内标峰面积值的RSD。

1.7.6中间精密度 不同实验人员于不同日期对6份重组蛋白制品（批号：20211011）进行衍生和液相分析，每份样品进样1 针，计算不同实验人员不同日期检测同一样品的RSD。

1.7.7准确度 将供试品和甘氨酸、组氨酸混合标准溶液，分别按1.4 项取上清液后，按低、中、高剂量（0.2、0.3、0.4 mL）加入经1.4 项处理的0.15 mL 重组蛋白上清液中，用水定容至1 mL，每组平行制备3份，经沉淀蛋白，按1.5和1.6项方法进行衍生、液相分析，计算甘氨酸、组氨酸加样回收率。

1.7.8溶液稳定性 分别取1 份供试品、标准溶液S3，按1.4 项处理后，按1.5 和1.6 项方法进行衍生、液相分析，将同一个样品分别在0、12、18、24、30、48 h进样分析，计算甘氨酸或组氨酸峰面积／内标峰面积值的RSD。

1.8数据采集及分析 使用Waters Empower 3 色谱数据软件采集和处理数据。

2 结果

2.1专属性 在甘氨酸、组氨酸出峰位置无可见干扰峰，符合专属性验证要求。内标峰与甘氨酸、组氨酸峰充分分离。见图1。

图1 α-氨基丁酸与甘氨酸、组氨酸分离的色谱图Fig.1 Chromatogram of Glycine and Histidine separated from α-aminobutyric

2.2线性 甘氨酸浓度在2.25 ～11.27µg／mL范围内，组氨酸浓度在72.85 ～364.24µg／mL范围内，标准曲线线性良好，R2分别为0.997、0.999，均＞0.99，见图2。

图2 甘氨酸（A）、组氨酸（B）标准曲线Fig.2 Standard curve of Glycine（A），Histidine（B）

2.3检测限 甘氨酸浓度为2.25 µg／mL 时，信噪比为2.5，为满足供试品检测要求，且信噪比接近3，因此确定甘氨酸检测限为2.25 µg／mL；组氨酸浓度为18.21 µg／mL 时，信噪比为17，确定为组氨酸的检测限为18.21µg／mL。

2.4定量限 甘氨酸浓度为4.69µg／mL、组氨酸浓度为32.86µg／mL时，两者信噪比分别为5和20，将此作为定量限，均低于供试品经衍生处理后甘氨酸（6.76µg／mL）和组氨酸（218.54µg／mL）理论含量。6 份定量限样品甘氨酸和组氨酸峰面积／内标峰面积值的RSD分别为9.2%和2.5%，符合验证要求。

2.5重复性 6 份样品甘氨酸浓度的RSD为4.6%，组氨酸浓度的RSD为5.0%，符合重复性验证要求。见表2。

表2 重复性验证结果（µg／mL）Tab.2 Verification for reproducibility（µg／mL）

2.6中间精密度 不同实验员不同日期检测甘氨酸浓度的RSD为6.9%，组氨酸浓度的RSD为2.0%，符合中间精密度验证要求。见表3。

表3 中间精密度验证结果（µg／mL）Tab.3 Verification for intermediate precision（µg／mL）

2.7准确度 甘氨酸低、中、高浓度的平均回收率分别为111.7%、108.7%、75.9%，各浓度回收率RSD分别为7.5%、2.8%、15.7%；组氨酸低、中、高浓度的回收率分别为97.3%、94.5%、88.9%，各浓度回收率RSD分别为0.8%、2.6%、9.7%。表明该方法准确度良好。

2.8溶液稳定性 在0、12、18、24、30、48 h 内，标准品衍生样品溶液甘氨酸浓度的RSD为4.3%，组氨酸浓度的RSD为3.4%；供试品衍生样品溶液甘氨酸浓度的RSD为7.7%，组氨酸浓度的RSD为3.3%。见表4。表明供试品在48 h内稳定。

表4 溶液稳定性验证（µg／mL）Tab.4 Verification for solution stability（µg／mL）

3 讨论

涉及到游离氨基酸含量检测的方法目前有分光光度法、氨基酸分析仪法、HPLC 法和液相色谱-串联质谱法、超临界流体色谱法、多维液相色谱法等［16-18］，受检测成本和应用范围的影响，在重组蛋白制品的测定中，HPLC 法为常用的测定方法［19-22］。但目前，RP-HPLC在针对重组蛋白检测的实际应用中多是仅测定1种氨基酸，且测定含量相对较高［23-24］。本研究建立的方法可同时检测两种含量相差数倍的游离氨基酸，其中甘氨酸的标准曲线在2.25 ～11.27µg／mL范围内。注射液中甘氨酸含量接近定量限，易受干扰，在一定程度上增加了甘氨酸检测难度，本研究为同时检测蛋白制品中两种含量相差数倍的游离氨基酸提供了思路。

本研究采用内标法，相比于外标法，内标法可校正物理和化学损失，提高测定的准确性［25-26］。α-氨基丁酸作为本研究内标，性质与甘氨酸、组氨酸相近，能完全溶解于供试品中，且能与待测氨基酸各峰充分分离，可满足甘氨酸、组氨酸含量的测定需求［27-28］。

本研究以AccQ·Fluor氨基酸衍生试剂作为衍生剂，柱前衍生过程为实验的关键步骤［29-30］，经优化，将在硼酸环境中定量的游离氨基酸与过量AccQ 衍生剂迅速混合，衍生时采用水平圆周振荡器IKA MS 3 basic，调整转速至500 r／min，此时溶液形成涡流状态，操作简单且衍生效果较好。各样品分别用计时器单独混匀15 s，快速操作，并保证衍生剂现用现配，以避免衍生剂与空气接触，经衍生生成的氨基酸衍生物较稳定。

本研究优化并明确了柱前衍生的操作，采用内标法同时测定出两种氨基酸。该方法专属性好，分离完全，重现性好，稳定性好，适用性较强，测定结果准确，可操作性强，可用于重组蛋白制品中甘氨酸、组氨酸含量的检测。