MF59佐剂在流感疫苗中的作用机制及其应用进展

宿诺综述，吴业红，张雪梅审校

长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春130012

流行性感冒（简称流感）是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，流感病毒因其基因多变性、宿主多样性，可在人群中广泛传播［1-2］，全球每年有3百万～5 百万人患有严重的流感相关疾病，25 万～50万人因流感死亡，曾多次引起世界性大流行。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐接种疫苗是预防流感病毒传播的最有效途径［3］，WHO每年均会针对流感病毒的流行状况预测下一年的流行毒株，将其作为疫苗参考毒株。但当流行毒株与疫苗毒株不匹配时，会降低疫苗有效性，从而导致流感发病率和死亡率增加，严重时甚至发生流感大流行［4-7］。因此，流感疫苗的免疫原性及其有效性是应该着重考虑的问题，也是降低接种流感疫苗的个体继续感染流感的关键。近年来新型疫苗不断研发，如病毒样颗粒流感疫苗、亚单位流感疫苗、重组蛋白流感疫苗等，均需与佐剂配伍使用，才可达到理想的免疫效果［8-10］。而MF59佐剂因其不产生“抗原库”效应等优点，已在上市疫苗中广泛使用。本文对MF59佐剂在流感疫苗中的作用机制及其应用进展作一综述，为研制MF59佐剂流感疫苗提供参考。

1 MF59佐剂简介

MF59 佐剂于1992 年由Novartis 公司研发，1997年在意大利批准用于流感疫苗复立达（英文商品名为Fluad®），是欧洲第一个被批准添加佐剂的流感疫苗［11-12］。目前Fluad®已在30 多个国家／地区上市。2008 年，我国食品药品监督管理局批准Fluad®在国内上市，成为我国目前唯一的老年专用流感疫苗。

MF59佐剂是由4.3%角鲨烯、0.5%聚山梨酯80（Tween80）和0.5%山梨醇酐油酸酯（Span85）、柠檬酸盐组成的水包油型乳剂，其颗粒直径约160 nm，密度约0.996 3 g／mL。Fluad®中的MF59 佐剂含有9.75 mg角鲨烯、1.175 mg Tween80、1.175 mg Span85、0.66 mg 柠檬酸钠、0.04 mg 柠檬酸和注射用水。角鲨烯是人细胞膜的天然成分，在生物合成途径中用于合成胆固醇并进一步产生类固醇激素，具有较好的生物相容性，在MF59 佐剂中作为油相。Tween80和Span85 是非离子表面活性剂，在MF59 佐剂中可稳定乳液液滴。柠檬酸盐缓冲液作为缓冲体系的作用是稳定溶液pH值［13-15］。

2 MF59佐剂的作用机制

通过定性和定量两方面进行评价，MF59 佐剂均能增强疫苗抗原免疫应答，诱导抗体反应［16-19］。MF59是在注射部位创造一个短暂的免疫活性局部环境，通过释放趋化因子（包括CCL2／3／4 和IL-18）募集大量关键免疫细胞，加快树突细胞分化，这些免疫细胞能够将抗原和佐剂运输至局部淋巴结，并诱导免疫反应的发生［20-21］。

MF59 佐剂还可募集中性粒细胞和单核细胞进行抗原提呈并引流至淋巴结，从而触发对疫苗抗原的适应性免疫应答。有研究者将MF59 佐剂和模式抗原进行荧光标记并注射至小鼠体内，检测到嗜酸性粒细胞及抗原提呈细胞等在肌肉细胞中往复运动，2 ～3周内会将抗原与佐剂共同引流至淋巴结［22-23］。其他研究也同样显示，MF59 佐剂注射部位的肌肉细胞中单核细胞数量相对增加了7倍［24］。由于CC趋化因子受体2（CC chemokine receptor 2，CCR2）的mRNA可在单核细胞、天然杀伤细胞和T 淋巴细胞中检测到，而在CCR2 缺陷小鼠中，MF59 佐剂注射后募集的免疫类细胞明显减少［25］，确定该作用依赖CCR2受体。

KO 等［26］研究显示，流感疫苗未能诱导CD4缺陷型小鼠IgG 抗体反应，表明流感疫苗需要CD4+T 细胞来诱导抗原与特异性IgG 抗体反应。随后在流感疫苗中加入MF59佐剂，并对CD4缺陷型小鼠和野生型小鼠进行免疫，检测IgG抗体反应能力，结果显示，CD4缺陷型小鼠不仅诱导了IgG抗体反应，而且与野生型小鼠的IgG抗体反应能力水平相当。表明MF59佐剂的加入可弥补流感疫苗免疫原性的不足，诱导免疫细胞产生免疫应答。此外，在流感疫苗中加入MF59佐剂，还可诱导CD4缺陷型小鼠产生血凝抑制（hemagglutination inhibiting，HAI）抗体，持久性的HAI 抗体在骨髓中分泌浆细胞、保护性CD8+T 细胞，完全保护机体免受流感病毒感染。因此，加入MF59佐剂的流感疫苗接种CD4 缺陷型小鼠后，在CD4 缺陷状态下可表现出促进IgG抗体同型转换、增强先天免疫应答、增强适应性免疫应答等作用。

MOSCA 等［27］研究显示，注射部位促炎基因上调，表明MF59佐剂还可驱动免疫细胞募集至肌肉组织中。通过免疫荧光分析监测CD11b 细胞发现，注射1 d 后，MF59 佐剂诱导CD11b 细胞流至肌肉组织；注射6 ～12 h 内，MF59 佐剂诱导主要组织相容复合物Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ）类基因（H2-Q、H2-K、H2-T、H2-D）上调；注射疫苗4 d 内，诱导MHCⅡ类基因（H2-Aa、H2-Ea、H2-Eb1）上调。与CpG或铝佐剂相比，MF59佐剂是更加有效的MHCⅡ类转录物诱导剂。

3 MF59佐剂在流感疫苗中的应用

3.1主要应用人群 流感不仅会导致幼儿因呼吸系统疾病住院，还与老年人的心血管及肺炎等疾病的高发病率和高死亡率相关。但季节性流感疫苗在幼儿及老年人使用过程中免疫原性差且效果不佳。而佐剂流感疫苗可通过提高免疫原性降低因流感引发严重疾病的概率。

相较成年人，幼儿／儿童处于生长发育期，免疫器官不成熟，对流感病毒免疫力较弱，且儿童呼吸道不健全，易受呼吸道病毒侵袭。因此，幼儿／儿童更易感染流感而引发疾病。

2009年，两种MF59佐剂单价流感疫苗（Focetria®和Celtura®）在H1N1流感大流行期间被许可用于儿童接种。2015 年，MF59 佐剂流感疫苗Fluad Pediatric®（0.25 mL／剂）在加拿大获批，适用于6 个月～2 周岁儿童［28］。

VESIKARI等［29］研究显示，在接种1剂包含MF59佐剂三价灭活流感疫苗（MF59-adjuvanted trivalent inactivated influenza vaccine，aTIV）后，6 ～36 个月儿童针对同源甲型H1N1 流感病毒株和H3N2 流感病毒株的抗体滴度抑制率分别为92%和95%，而同年龄段在无佐剂三价灭活流感疫苗（TIV）受种者中分别为20%和12%；36 ～72 个月儿童aTIV 受种者中针对同源甲型H1N1 和H3N2 流感病毒株的抗体滴度抑制率分别为100%和97%，而同年龄段TIV 受种者中分别为63%和60%。此外，在181 d 时，aTIV 受种者血清保护率为98%～100%，而TIV受种仅为49% ～65%。表明针对6 ～72 个月儿童受种者，加入MF59佐剂可提高机体抗体滴度至少1倍。

VESIKARI 等［30］研究显示，将包含MF59 佐剂四价灭活（亚单位）流感疫苗［MF59-adjuvanted, quad rivalent, inactivated (subunit) influenza vaccine，aIIV4］与无佐剂四价灭活流感疫苗（IIV4）分别随机双盲接种6个月～5周岁儿童。结果显示，相比于各年龄段，aIIV4 的免疫应答作用均优于IIV4，相比IIV4 组，GMT 比率和针对同源和异源毒株的血清阳转率更高。与2 ～5 周岁儿童相比，2 周岁以下儿童免疫反应差异最大。接种aIIV4后，多于40.3%的儿童参与者可以达到1∶629 或更高的血凝抑制抗体滴度阈值。此外，这种增强作用在6 ～23 个月儿童中最明显。表明MF59佐剂提高抗体滴度的同时，又可对免疫功能稍弱儿童群体提供更高的保护效力。

与幼儿／儿童不同的是，老年人免疫器官衰竭导致免疫功能下降，使疫苗免疫效力不如成年人，相对较差。WHO 建议对65 周岁以上成年人进行年度流感疫苗接种。据估计，18 ～65 周岁成年人疫苗效力为60%，50 ～65 周岁成年人为51%，而65 周岁及以上成年人为37%［31-33］。老年人的自然衰老过程导致免疫应答水平降低，且对疫苗接种的抗体反应低于年轻人，为提高老年人接种流感疫苗的有效性，可使用佐剂或者增加疫苗中抗原含量。

SQUARCIONE 等［34］研究表明，将MF59 佐剂流感亚单位疫苗（Fluad®，Chiron Vaccines，Siena，Italy）与流感裂解疫苗（Vaxigrip®，Vaxigrip，Aventis Pasteur MSD，Lyon，France）随机接种75 周岁以上老年人，对比发现，受试者中佐剂组的血清保护率和血清阳转率均高于非佐剂组。

有研究表明，包含MF59佐剂四价裂解流感疫苗（MF59-adjuvanted quadrivalent splitinfluenzavaccine，aQIV）的作用更优于MF59 佐剂三价流感裂解疫苗（aTIV）。在65 周岁以上老年人中，aQIV 相比常规非佐剂流感疫苗能诱导更加有效的免疫应答。此外，aQIV 不仅诱导出同源流感病毒株相当的免疫原性和安全性，而且还引起了未包括在aTIV中的BY型毒株的免疫应答。表明aQIV 可提供比aTIV 更广泛的保护。老年人不仅易发生流感并发症，且在发生抗原错配或抗原漂移的年份更易受到影响，且流感季节发生这种情况的概率约为25%，因此以上发现对老年人具有重要意义［35-36］。

3.2剂量应用 为提高流感疫苗有效性，通常会选择增加抗原剂量，但增加抗原剂量的同时也会增加其反应原性。而MF59 佐剂在提高流感疫苗免疫原性的同时，还可节省抗原剂量。

有研究表明，无论在青壮年还是老年人中，全剂量7.5µg（H5N1 HA 含量）加0.25 mL MF59 产生的免疫原性是MF59 佐剂与H5N1 亚型最佳混合比例，与多篇文献报道相符［37-40］。此外，2剂量7.5µg MF59佐剂H5N1 流感疫苗间隔3 周进行接种，耐受性好，免疫原性高，无不良反应。在成年及老年受试者中，均可引起强烈的免疫反应，并符合美国和欧盟监管机构的标准。

DELLA CIOPPA 等［41］研究表明，通过筛选疫苗研究组（包括7.5 µg TIV、7.5 µg QIV、15 µg TIV 和15 µg QIV 组，分别与0、12.5%、25%、50%或100%MF59佐剂剂量进行组合），得出50%MF59佐剂剂量与7.5 µg TIV／QIV 混合时，为最佳比例，在显著提高免疫原性和良好耐受性前提下，也提供了最佳平衡体系。线性回归分析显示，随着MF59 剂量的增加，QIV 4种流感病毒株的抗体反应均显著增加。在较高抗原剂量下测得的斜率始终高于较低抗原剂量下，表明增加抗原与MF59 结合的剂量，可提高流感毒株的抗体反应。5 种不同比例MF59 佐剂剂量与TIV／QIV 混合，第1 次接种仅50%和100%MF59佐剂剂量组符合欧盟人用药委员会（Committee for Medicinal Products for Human Use，CHMP）标准，第2次接种后各MF59 佐剂剂量组均符合欧盟CHMP 标准。此外，单一毒株与MF59 佐剂混合的疫苗接种后，免疫效果一般会较高，对甲型流感毒株具有重要的临床意义。

3.3流感毒种型别应用 甲型H5N1流感病毒，起源于家禽和野生鸟类，可传染给人类。禽流感大流行后，需要开发具有交叉保护、安全性强、免疫原性高的大流行候选A／H5N1 疫苗。研究者将MF59 佐剂与H5N1 流感裂解疫苗、H5N1 亚单位流感疫苗进行混合，均发现其耐受性良好且免疫原性较高，符合美国和欧盟大流行流感疫苗许可标准［42-47］。

1918 年甲型H1N1 流感大流行导致全世界约5 000万人死亡；2009年甲型H1N1流感大流行期间，低于18 周岁的年轻人感染流感的风险高于老年人，与65 周岁老年人相比，青少年患临床疾病的累积率增加了30 ～80 倍［48］。研究者在H1N1 流感裂解疫苗、H1N1亚单位流感疫苗、H1N1重组流感疫苗中加入MF59 佐剂，结果显示，加入MF59 佐剂的疫苗组GMT更高［49-54］。

四价流感疫苗组份含A（H1N1）亚型、A（H3N2）亚型和B型Victoria系、B型Yamagata系，较三价流感疫苗多了B／Yamagata亚型，预防流感毒株的范围更广。研究者在四价流感裂解疫苗和四价亚单位流感疫苗中加入MF59 佐剂，通过与MF59 佐剂三价流感疫苗对比，MF59 佐剂四价流感疫苗均优于MF59 佐剂三价流感疫苗，且适用于各年龄段人群。安全性和耐受性良好，未发生疫苗有关严重不良事件［55-59］。

4 小结与展望

MF59 佐剂的研究始于20 世纪90 年代初，成为获批上市的第二种用于疫苗的佐剂，通过研究人员的不断努力，MF59 佐剂已成功应用于人类疫苗。以上实验数据表明，MF59 佐剂具有安全性、有效性及高效性等优点，并在免疫机体后诱导产生持续的体液免疫，减少抗原使用量的同时也诱导了较高的抗体水平。MF59 佐剂无论与三价或四价流感疫苗混合，在6个月～2周岁儿童及65周岁以上老年人中均能产生较高的免疫原性，且最佳配伍比为7.5µg（抗原HA含量）+0.25 mL（7.5µg TIV／QIV+50%MF59）。现有数据表明，MF59 佐剂可与H1N1 亚型、H5N1 亚型、三价流感疫苗、四价流感疫苗进行配伍，可显著提高其免疫原性，仅出现轻微不良反应，且临床试验中未发生遗传毒性、致畸、致敏或致死等安全性问题，仅极少数志愿者出现注射部位局部炎症反应，表明加入MF59 佐剂的流感疫苗耐受性良好。尽管MF59 佐剂有较多的研究成效，但对其作用机制，如导致抗体和T 辅助细胞反应的先天受体和信号、应激反应信号、组织损伤以及代谢和营养感应途径的相关性了解较少。目前，也出现将MF59佐剂与人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）等疫苗制剂配伍的报道［60］。在科学不断发展和进步中，将进一步了解并完全阐释MF59佐剂的作用机制，并将其应至更多疫苗中。