SARS-CoV-2灭活疫苗（Vero 细胞）中宿主细胞DNA残留量荧光定量PCR检测方法的建立及验证

程小玲，施金荣，张雪婷，申瑷琳，何婧雯，程尧，段凯

武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北武汉430207

新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARSCoV-2）引起的急性感染性肺炎［1］。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计数据显示，截至2022年4月4日，全球489 779 062人确诊感染SARACoV-2，导致超过615 万人死亡［2-3］。SARS-CoV-2 为冠状病毒科单股正链RNA 病毒，是造成COVID-19疫情大暴发的主要病原体［4-7］。为应对COVID-19 的全球流行，各国纷纷开始研制如核酸疫苗、灭活疫苗等多种类型的疫苗，以期通过接种疫苗的方式预防COVID-19，阻断SARS-CoV-2 在人群中的传播以及降低重症率［8-9］。而通过哺乳动物细胞系制备的生物制品可能含有外源性宿主细胞残留的杂质，因此必须在下游工艺对宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质等进行清除［10-11］。其中，宿主细胞的外源性DNA 进入人体后存在一定的安全风险，可能传递引发肿瘤，或存在的逆转录病毒整合至人体基因组后导致病毒感染，从而威胁疫苗接种者的健康，因此，对疫苗的宿主细胞DNA残留量进行检测是疫苗生产过程中非常重要的一项质量控制环节［12-14］。

目前国内常用的外源性DNA残留量检测方法主要有DNA 探针杂交法、荧光染色法和定量PCR 法。其中探针杂交法耗时长，步骤繁琐，且仅为半定量，不够准确［15］；荧光染色法较为简便，耗时短，但线性范围较窄，灵敏度低，DNA 残留量低于1.25 ng／mL 时一般无法准确定量［16-17］。实时定量PCR 方法近年发展迅速，广泛应用于分子生物学、医药等多个研究领域，其优势在于可通过观察荧光信号的积累确定PCR反应中的初始模板量，从而达到更高的检测精度。本研究旨在建立SARS-CoV-2 灭活疫苗（Vero 细胞）中宿主细胞DNA 残留量荧光定量PCR 检测方法，并进行验证。

1 材料与方法

1.1供试品 SARS-CoV-2灭活疫苗（Vero 细胞）原液（批号分别为202110Y040、SX202201Y001、SX202201-Y002、SX202201Y003、SX202201Y004、SX202202Y005）由本公司制备。

1.2主要试剂及仪器 Vero 残留DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）和宿主细胞残留DNA 样本前处理试剂盒（磁珠法）购自湖州申科生物技术有限公司；异丙醇、无水乙醇等试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；荧光定量PCR 仪（型号：ABI 7500Fast）购自美国ABI 公司；HCD 前处理系统（型号：SKRDP-32）购自湖州申科生物技术有限公司。

1.3供试品残留DNA 的提取 采用磁珠法对供试品中DNA 进行提取和纯化，按试剂盒说明书操作：取100 µL 供试品，加入10 µL 浓度为5 mol／L 的氯化钠溶液、10 µL 蛋白酶K 及100 µL 蛋白酶K 缓冲液，混匀，55 ℃孵育1 h 后，置于HCD 前处理系统，在深孔板对应孔内加入工作结合液、异丙醇、洗涤液A、洗涤液B、磁珠及洗脱液，使用rDNA purify 程序进行提取，洗脱后收集DNA。

1.4定量PCR 反应 采用Taqman探针法，根据试剂盒说明书操作，对供试品中Vero 细胞DNA 含量进行测定。按照试剂盒说明书配制PCR 反应体系Vero荧光定量PCR Mix，使用7500Fast 定量PCR 仪进行DNA片段扩增，两步法反应程序设置：选择报告荧光基团FAM，猝灭荧光基团为none，检测参比荧光ROX。95 ℃预变性10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 个循环；反应体积30µL。每个循环退火延伸步骤结束时采集荧光信号，根据标准曲线计算供试品Vero 细胞DNA的初始浓度。

1.5方法的验证

1.5.1线性范围 使用Vero残留DNA检测试剂盒中的Vero DNA 定量参考品（S0）配制浓度为300（S1）、30（S2）、3（S3）、0.3（S4）、0.03（S5）、0.003（S6）pg／µL的参考品，以循环数（CT值）为横坐标，DNA 浓度为纵坐标绘制标准曲线，计算R2、斜率以及标准品、阴性质控（NCS）和无模板对照（NTC）的CT值。试验重复3次。

1.5.2重复性和中间精密度 取供试品（批号：202110-Y040）12份，每份100µL，其中6份分别加入30 pg／µL的标准品10µL 作为加标供试品，由检验员1在同一设备上分别对供试品及加标供试品进行6 次平行提取DNA 和宿主细胞DNA 含量测定，分别计算供试品和加标供试品6 次平行测定结果间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），验证方法的重复性。由检验员2 在不同时间对同一批供试品和加标供试品分别进行6次平行提取DNA和宿主细胞DNA含量测定，分别计算供试品和加标供试品6 次平行测定结果间及不同人员供试品和加标供试品测定结果间的RSD，验证方法的中间精密度。

1.5.3定量限 配制浓度分别为0.01、0.003、0.001、0.000 3 pg／µL 的标准品，重复测定6 次，计算同一浓度测定结果间的RSD及回收率。重复孔的变异系数（CV）≤30%且回收率为50% ～150%的浓度确定为该方法的定量限。

1.5.4专属性 使用样品稀释液和纯化液稀释液对供试品及加标供试品进行稀释，对供试品及加标供试品进行3 次平行提取DNA 和宿主细胞DNA 含量测定，分别计算不同稀释条件下供试品和加标供试品测定结果间的RSD。

1.5.5耐用性 取供试品和加标供试品，分别于53、55、57 ℃条件下孵育60 min，55 ℃条件下孵育56、60、64 min，对供试品及加标供试品进行平行提取DNA和宿主细胞DNA 含量测定，计算不同孵育温度及孵育时间测定结果间的RSD。

1.5.6准确度 对供试品及加标供试品分别进行6次平行提取和宿主细胞DNA 含量测定，计算供试品及加标供试品6 次平行测定的加标回收率，以及供试品和加标供试品测定结果间的RSD。

1.6方法的适应性 采用建立的方法检测5 批（批号：SX202201Y001、SX202201Y002、SX202201Y003、SX202201Y004、SX202202Y005）SARS-CoV-2 灭活疫苗（Vero 细胞）原液中的Vero 细胞DNA 残留量，确定该方法的适应性。

1.7数据采集及分析 采用ABI 7500Fast 荧光定量PCR 仪自带分析软件SDS v1.5.1 计算供试品的Vero细胞DNA浓度。

2 结果

2.1方法的验证

2.1.1线性范围 3次测定线性拟合的标准曲线R2均为0.999，斜率在-3.5 ～-3.4 之间，见表1。表明该方法在300 ～0.003 pg／µL之间具有良好的线性。

表1 线性范围验证结果Tab.1 Verification for linear range

2.1.2重复性和中间精密度 检验员1 供试品和加标供试品6 次平行测定结果的RSD分别为4.5%和1.0%，检验员2 供试品和加标供试品6 次平行测定结果的RSD分别为4.0%和1.6%，表明该方法重复性较好；两名检验员12 次平行测定供试品和加标供试品结果的RSD分别为19.5%和12.2%，表明该方法中间精密度较好。见表2。

表2 重复性和中间精密度验证结果（pg／µL）Tab.2 Verification for repeatability and intermediate precision（pg／µL）

2.1.3定量限 0.01、0.003、0.001和0.000 3 pg／µL浓度参考品6次重复测定结果间的RSD分别为16.4%、18.0%、20.2%和90.3%，回收率分别为130.3%、108.9%、86.7%和111.1%，见表3。标准品浓度为0.001 pg／µL时，测定结果满足RSD≤30%，回收率在50%～150%，确定该方法的定量限为0.001 pg／µL。

表3 定量限验证结果（pg／µL）Tab.3 Verification for quantitative limit（pg／µL）

2.1.4专属性 使用样品稀释液与纯化液稀释液稀释的供试品检测值间的RSD为3.4%，加标供试品检测值间的RSD为5.9%，见表4。表明样品稀释液对测定结果无明显影响。

表4 专属性验证结果（pg／µL）Tab.4 Verification for specificity（pg／µL）

2.1.5耐用性 供试品和加标供试品于53、55 和57 ℃条件下孵育60 min 检测结果间的RSD分别为1.6%和0.8%，见表5；供试品和加标供试品于55 ℃条件下孵育56、60 和64 min 检测结果间的RSD分别为2.0%和7.1%，见表6。表明该方法在不同孵育温度和孵育时间条件下耐用性良好。

表5 孵育温度耐用性验证结果（pg／µL）Tab.5 Verification for incubation temperature durability（pg／µL）

表6 孵育时间耐用性验证结果（pg／µL）Tab.6 Verification for incubation time durability（pg／µL）

2.1.6准确度 6 次平行测定的加标供试品回收率在79% ～83%之间，供试品和加标供试品测定结果的RSD分别为4.5%和1.0%，见表7。表明该方法准确度较高。

表7 准确度验证结果（pg／µL）Tab.7 Verification for accuracy（pg／µL）

2.2方法的适应性 5 批供试品的加标回收率均在50% ～150%之间，见表8。表明该方法检测SARSCoV-2灭活疫苗（Vero 细胞）原液中宿主细胞DNA 残留量适应性良好。

表8 适应性验证结果Tab.8 Verification for applicability

3 讨论

为了确保SARS-CoV-2 灭活疫苗（Vero 细胞）的安全性，需持续关注生产工艺中宿主细胞DNA 的去除程度［18-19］。由于Vero 细胞易培养、生长快、能进行规模化的病毒培养，人用灭活疫苗大多采用Vero 细胞作为基质进行生产。但宿主细胞DNA 潜在的致癌性和感染性仍是关注的热点。研究发现，Vero 细胞具有致瘤性，外源性DNA 的插入会导致原癌基因的激活及抑癌基因的失活［20-21］。宿主细胞DNA 残留常被认为是疫苗制品存在的潜在危险因素，影响疫苗制品的安全性［22］。因此，Vero 细胞残留DNA 检测是疫苗生产过程中的关键质控点。

目前，荧光定量PCR 法主要分为SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探针法，其中SYBR GreenⅠ染料法成本较低，但特异性不强，易产生假阳性信号；TaqMan探针法需针对不同序列合成对应的探针，过程较复杂，成本偏高，但由于合成的扩增分子猝灭时释放的荧光基团数量一定，不受扩增产物片段大小的影响，检测结果更为准确［23-25］。本公司规定DNA 残留量应不高于100 pg／剂，《中国药典》三部（2020版）中未收载SARS-CoV-2 灭活疫苗（Vero 细胞）DNA 残留量检测的具体方法，本研究依据《中国药典》三部（2020版）通则3407“外源性DNA 残留量测定法”的定量PCR 法，选取磁珠法结合Taq-Man 探针法对本公司研制的SARS-CoV-2 灭活疫苗（Vero 细胞）原液进行方法建立及验证。验证结果显示，建立的方法在0.003 ～300 pg／µL范围内具有较好的线性，且重复性、中间精密度、耐用性良好，定量限为0.001 pg／µL，样品稀释液对测定结果无明显影响，准确度较高，适用性良好。

综上所述，本研究建立的荧光定量PCR 检测方法操作简单、检测时间短、效率高、专属性强、重复性好，可满足SARS-CoV-2 灭活疫苗（Vero 细胞）中宿主细胞DNA残留量检测的需求。