高通量测序技术应用于稽留流产遗传因素的分析

张 康 李向利 蒋国庆

1.清华大学第一附属医院妇科，北京 100016；2.清华大学第一附属医院病理科，北京 100016

稽留流产指胚胎或胎儿死亡后滞留在宫腔未能及时排除，是自然流产的一种特殊状态，其病因复杂多样，包括染色体、内分泌、免疫、感染、解剖、血栓前状态等，并且仍有50%病因不明[1-3]。其中，胚胎的遗传缺陷是导致稽留流产的重要因素[4]。近年来，随着高通量基因测序技术的发展，绒毛染色体检测开始广泛应用于稽留流产原因分析及产前诊断等多个领域。本研究应用高通量测序技术检测稽留流产患者绒毛组织基因拷贝数变异情况，评估该技术应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年6 月至2020 年6 月清华大学第一附属医院门诊确诊为稽留流产并且行清宫手术的91例患者为研究对象，对流产绒毛组织进行高通量测序分析。孕妇年龄22～42 岁，平均（31.26±4.10）岁；孕龄6～13周，平均（9.15±1.65）周。纳入标准：①尿或血绒毛膜促性腺激素阳性；②超声符合稽留流产指标。排除标准：①孕妇自身内分泌系统异常、支原体及衣原体感染、生殖系统解剖结构异常；②孕期有毒、有害物质接触史等。患者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准[（2022）伦审研第（57）号]。

1.2 检测方法

清宫术后，流产组织经无菌生理盐水洗涤3 次，漂净后置冰盒保存，送至北京科诺安生物技术有限公司进行高通量测序。采用拷贝数变异检测试剂盒（货号：KR2000，杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司），依托基因测序仪（型号NextSeq CN500，杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司），进行全基因组范围扫描，包括DNA 提取、纯化、建库、测序、信息分析、报告出具等步骤。同时取孕妇外周血2 ml 送检做参考，以排除绒毛染色体是否受到母源性污染。

2 结果

2.1 绒毛组织高通量测序结果

91 例稽留流产绒毛组织均成功进行高通量测序，成功率为100.00%。21 例（23.92%）染色体正常，70 例（76.08%）染色体异常；有明确致病性50 例（54.94%）；染色体异常样本中，以染色体数目异常最为常见，三体最多。见表1。

表1 绒毛染色体拷贝数变异结果

2.2 染色体拷贝数变异样本分析结果

26 例染色体拷贝数变异中，微缺失型6 例、微重复型14 例、混合型6 例。其中6 例具有明确致病性、2例良性、18 例为临床意义未明的基因组拷贝数变异。相关结果见表2。

表2 染色体拷贝数变异样本分析结果

2.3 已知致病性拷贝数变异样本分析结果

6 例具有明确致病性样本的具体检测结果见表3。

表3 已知致病性拷贝数变异样本分析结果

3 讨论

近年来，稽留流产发病率逐渐升高，给孕妇及其家庭带来身体和心理的双重伤害。稽留流产病因复杂多样，包括遗传、免疫、感染、解剖、环境、精神等[4-5]。染色体异常是最常见原因[6]。

传统的G 显带核型分析法被作为检测染色体数目异常和结构异常的金标准，但其对标本要求高，实验周期长，且分辨率低，对于＜5 Mb 的微小染色体畸变难以检出[7]。研究显示，染色体核型分析正常的细胞中可能存在亚显微水平的缺失、重复等拷贝数变异[8]。如果拷贝数变异涉及与生长发育相关的重要基因片段的缺失、插入或重复，最终可能会导致胎儿死亡或流产[9]。荧光原位杂交法虽然检测时间短，但只能对13、16、18、21、22、X 和Y 染色体进行检测，不能分析全部染色体和全基因组结构，且有20%漏诊的概率[10-11]。本研究应用高通量基因测序技术拷贝数异常，不仅能检测46 条染色体非整倍体异常，还能检测出＞100 kb 片段的微缺失、微重复，发现新的染色体变异。该项技术对绒毛组织要求低，分辨率高，检测速度快，最大的优势在于可以发现不同区域染色体拷贝数变异，具有极高的灵敏度和特异度[12]，弥补染色体核型分析和荧光原位杂交法的不足，使得流产的病因学诊断更全面[13-14]。

本研究采用高通量测序检测绒毛组织的同时，抽取母亲外周血进行结果验证，排除母体细胞污染的影响，使结果更加准确。全部标本均成功进行染色体检测，说明该技术比以往检测技术更加可靠。本研究结果显示，91 例样本中，检测出拷贝数异常的样本共70例，异常率为76.08%，有明确致病性50 例（54.94%），与既往文献[13,15-16]报道的染色体异常率一致。本研究结果显示，以染色体数目异常最为常见，三体最多；非整倍体中，21-三体所占比例最高，有5 例，其次是15-三体、16-三体。与既往研究[17-18]（常染色体三体是染色体异常的主要核型）相符。由此可见，染色体数目异常是胚胎停育的主要原因[19]。

染色体拷贝数变异共26 例，其中重复有14 例、缺失有6 例、混合型6 例；重复率高于缺失率，与张攀等[20]研究结果一致，提示染色体的重复比起缺失可能更容易影响胚胎的发育。本研究中明确有致病性拷贝数变异6 例、良性2 例、临床意义未知18 例。由于目前技术有限，这些缺失或重复片段的致病性还没有完全明确，由于其结构异常片段相对较小，容易得到基因补偿而无特殊临床症状表现。染色体微缺失或微重复是患儿多发畸形的主要原因[21-22]，但与稽留流产是否相关还需要进一步研究来证实。

目前，人类基因数据库无法对全部的结果进行临床性质判断，所以对于临床意义未明的拷贝数变异无法明确是否会导致不良妊娠，还需要更多的研究来明确。如果检测结果为染色体数目异常，考虑遗传之外的因素所致概率较高，如环境、感染、高龄等因素，导致生殖细胞或受精卵在早期有丝分裂过程中出现染色体不分离或者丢失，可基本排除来自夫妻双方的遗传畸变，需要告知夫妻尽可能避免接触导致染色体异常的不良因素。如果绒毛组织存在拷贝数变异，则需要进一步分析拷贝数变异是否来自亲代，抑或是新发突变，建议夫妻双方均检测染色体拷贝数变异，并辅以家系综合评估，确定该缺失或重复的来源，分析拷贝数变异的多态性影响。无论为新发突变还是来自双亲遗传，再次妊娠时都需要进行遗传咨询和产前诊断。任何一项技术都具有局限性，拷贝数变异目前无法检测出染色体平衡性结构异常（包括染色体平衡易位及倒位）、多倍体等[23]，还需要结合染色体核型分析进行诊断[24-27]。

综上所述，染色体异常是早孕期稽留流产的主要原因，其中又以染色体数目异常为主。在染色体亚显微水平上，高通量测序技术具有明显优势，可以更高效、灵敏、准确地检测绒毛染色体数目异常和拷贝数变异，是对传统绒毛核型分析的有效补充，有助于全面明确稽留流产的病因，为夫妻双方再次生育提供更有意义的优生遗传咨询和指导。