DIO1 抑制喉鳞状细胞癌侵袭转移的机制研究

任 楠 刘金婧 徐海铭 赵 凯 刘明波

1.解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部，北京 100853；2.解放军总医院海南医院耳鼻咽喉头颈外科，海南三亚 572013

喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是喉部最常见的恶性肿瘤[1]，位于头颈部恶性肿瘤的第三位[2]。LSCC 的局部复发和转移[3-4]，使多数患者的预后较差[5]。因此，在分子水平上探索调控LSCC 侵袭转移中的关键因子，对LSCC 的早期诊断及治疗起着重要作用。课题组前期工作中，应用TCGA 数据库构建了LSCC 的ceRNA 网络，通过生存分析发现2 个与预后相关的mRNA [碘甲原氨酸脱碘酶Ⅰ（deiodinase iodothyronine type Ⅰ，DIO1）和STC2][6]。DIO1 属于脱碘酶硒蛋白家族[7-8]，其可调节活化甲状腺激素的生物利用度[9-12]，控制细胞增殖、分化和代谢[13-15]。本研究探讨TU686 细胞系中DIO1 的表达，及对LSCC 增殖、迁移、侵袭的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞

人喉鳞状细胞癌TU686 细胞系由解放军总医院海南医院耳鼻咽喉头颈外科课题组传代培养。

1.2 实验试剂和仪器

转染试剂LipofectamineTM2000（Invitrogen，批号：15596026）；PCDNA3.1 质粒表达载体（上海吉凯基因医学科技股份有限公司，批号：GOSA0355591-1）；CCK-8试剂盒（Beyotime，货号：C0040）；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、S6K1、4EBP1、Akt 抗体（Abcam，货号：ab227639、ab207608、ab137321、ab131440、ab2606、ab18785）。低温离心机（Sigma，型号：3-18K）；实时荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems，型号：StepOne）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养、转染及分组 将细胞接种至含有10%胎牛血清和青-链霉素双抗的DMEM 培养基中培养，细胞密度达到80%～90%时进行传代或后续实验。TU686 细胞接种至培养皿中，密度达到80%时进行转染。使用培养基稀释DIO1 质粒、转染试剂混合，后将复合物加入培养皿中，轻轻混匀。转染1 d 后细胞传代进行后续实验。将正常TU686 细胞设为对照组，转染后的TU686 细胞为DIO1 过表达组，根据过表达量继续分为DIO1-1 μg 组、DIO1-2 μg 组。

1.3.2 RT-qPCR 验证DIO1 的表达 提取各组细胞总RNA，RT-qPCR 将DIO1 逆转录为cDNA 并扩增，设置3 个复孔（GAPDH 为内参）。反应条件：95℃预变性1 min，共1 个循环；变性95℃20 s，退火60℃20 s，延伸72℃30 s，共40 个循环。反应体系共20 μl：cDNA 2 μl，master mix 10 μl，正向引物1 μl，反向引物1 μl，ddH2O 6 μl。反应完成后，采用2-△△Ct法计算DIO1 的表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.3 Western blot 检测DIO1、E-cadherin、Ncadherin、Vimentin、p-S6K1、S6K1、p-4EBP1、4EBP1、p-Akt、Akt 的表达 收集各组细胞，每组均设3 个复孔，裂解细胞提取蛋白；SDS-PAGE 法分离蛋白质、转膜，封闭洗膜。一抗浓度为1∶1 000，4℃孵育过夜；二抗浓度为1∶2 000，室温孵育；ECL 法显色（GAPDH 为内参）。

1.3.4 CCK-8 实验检测细胞增殖能力 将各组细胞接种于96 孔板中，每组均设3 个复孔，贴壁后加入CCK-8溶液。酶标仪测定第24、48、72 h 的450 nm 波长的光密度（optical density，OD）值，绘制细胞生长曲线。

1.3.5 PI/DAPI 染色检测细胞凋亡情况 将各组细胞培养皿用PBS 漂洗，每组均设3 个复孔，DAPI/PI 液室温染色，封片剂封片，进行荧光显微镜观察。

1.3.6 划痕实验检测细胞迁移能力 将各组细胞接种至6 孔板中，每组均设3 个复孔，待细胞密度达到80%以上时，用枪头在孔中划出直线，间隔24 h 后观察细胞分布并拍照。

1.3.7 Transwell 实验检测细胞迁移及侵袭能力 将各组细胞接种至Transwell 上室，每组均设3 个复孔，培养后使用甲醛固定，Giemsa 染色，擦去上室中的细胞，显微镜观察下室层面的细胞，拍照，计数。侵袭能力：小室经基质胶预处理，其他方法同上。

1.3.8 基因富集情况 分析DIO1-1 μg 组、DIO1-2 μg组上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及mTORC1 信号通路相关基因的差异表达情况，得到受DIO1 表达影响的相关基因，并进行基因探针富集分析，检测相关基因集的富集情况。

1.4 统计学方法

采用R 14.2.1 统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后TU686 细胞的DIO1 表达

DIO1 过表达组DIO1 mRNA、蛋白水平高于对照组（P＜0.01）。见图1。

2.2 转染后TU686 细胞的生存能力

24、48、72 h，DIO1 过表达组OD 值低于对照组（P＜0.01）；DIO1 过表达组PI 染色阳性比例高于对照组（P＜0.01）。见图2。

图2 转染后TU686 细胞的生存能力

2.3 转染后TU686 细胞的迁移能力

DIO1 过表达组相对迁移距离短于对照组（P＜0.01）。见图3。

图3 转染后TU686 细胞的迁移能力

2.4 转染后TU686 细胞的迁移及侵袭能力

DIO1 过表达组迁移及侵袭能力低于对照组（P＜0.01）。见图4。

图4 转染后TU686 细胞的迁移及侵袭能力

2.5 转染后TU686 细胞EMT 进程的变化

NES＜0 即DIO1 的表达与EMT 相关基因集的表达呈负相关。DIO1-1 μg 组、DIO1-2 μg 组E-cadherin高于对照组，N-cadherin、Vimentin 低于对照组（P＜0.01）。见图5。

图5 转染后TU686 细胞EMT 进程的变化

2.6 转染后TU686 细胞mTORC1 信号通路的变化

NES＜0 即DIO1 的表达与mTORC1 信号通路相关基因集的表达呈负相关。DIO1-1 μg 组、DIO1-2 μg 组p-S6K1 和p-4EBP1 低于对照组（P＜0.01）。DIO1-1 μg组、DIO1-2 μg 组与对照组p-Akt 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图6。

图6 转染后TU686 细胞mTORC1 信号通路的变化

3 讨论

目前，虽然手术是LSCC 的主要治疗方式[16-18]，但是发现新靶点及预后分子对LSCC 的研究至关重要[19-23]。本研究构建稳定过表达DIO1 的TU686 细胞系发现，DIO1 可以抑制肿瘤细胞的生存、迁移及侵袭能力及EMT。GESA 分析发现，mTORC1 信号通路与DIO1 呈负相关，且mTORC1 底物在转染后细胞呈现低表达，且mTORC1 信号通路可以调控EMT 的进程[24-25]，提示在LSCC 中，DIO1 可能是通过mTORC1 信号通路调节EMT 的进程。

综上所述，DIO1 可以抑制LSCC 的增殖、侵袭及转移，作为抑癌基因在LSCC 侵袭转移过程中起着关键作用，为LSCC 发生发展中的机制提供了新方向。