顶空气相色谱法测定6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮残留量

齐秋焕 黄春华 郑学学 韩 菲 王翠杰 李向群

北京民海生物科技有限公司，北京 102600

肺炎链球菌为革兰氏阳性菌，有毒株在体内形成荚膜，其荚膜多糖为重要致病物质，可引起肺炎、脑膜炎、支气管炎、心内膜炎等疾病[1-3]。23 价肺炎球菌多糖疫苗能有效预防老年人下呼吸道感染[4-7]。肺炎球菌精制多糖是生产各种肺炎类疫苗的基本成分。肺炎球菌精制多糖生产过程中沉淀核酸、粗制多糖和精制多糖引入乙醇，在清洗粗制多糖和精制多糖时引入丙酮。乙醇略有毒性，能达到一定的麻醉效果，主要抑制中枢神经系统。当乙醇摄入量增大时，可引起延髓血管运动中枢和呼吸中枢麻痹。丙酮为低毒类致癌物，主要对中枢神经系统有麻醉作用[8]。它们对人体有一定危害，因此必须控制乙醇、丙酮残留量。目前，国内对于化学药、原料药中有机溶剂残留量检测已有相关文献记载[9-17]，但关于疫苗中有机溶剂残留量检测方法文献较少[18]，且尚未有肺炎球菌精制多糖测定乙醇、丙酮残留量的方法[8,19-24]。因此，本研究采用顶空气相色谱法对6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮残留量检测方法进行方法学验证，按照外标法方法进行计算。

1 仪器与试药

1.1 试剂及仪器

6B 型肺炎球菌精制多糖（样品批号：38-6B-22202001、38-6B-22203002、38-6B-22203003、38-6B-22204004、38-6B-22205005、38-6B-22206006、38-6B-22206007、38-6B-22210008、38-6B-22210009，北 京民海生物科技有限公司）；无水乙醇对照品（批号：20170522，气相色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；丙酮对照品（批号：20170511，气相色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验室用水为注射用水和纯化水。气相色谱仪（GC-2010 Plus AF，岛津公司）；顶空进样器（HS-20，岛津公司）；DB-624 毛细管柱（30 m×0.25 mm 膜厚1.80 μm，Agilent Technologies）。

1.2 溶液制备

1.2.1 供试品溶液 用纯化水将6B 型肺炎球菌精制多糖溶解成5 000 μg/ml 的溶液。

1.2.2 乙醇、丙酮对照品贮备液 称取无水乙醇210 mg、丙酮280 mg 加入100 ml 容量瓶中，用注射用水定容至刻度。摇匀，得到2 100 μg/ml 乙醇、2 800 μg/ml 丙酮对照品贮备液。

1.2.3 乙醇、丙酮对照品溶液 量取2 100 μg/ml 乙醇、2 800 μg/ml 丙酮对照品贮备液1 ml 到100 ml 容量瓶中，用注射用水定容至刻度，摇匀，得到21 μg/ml 乙醇、28 μg/ml 丙酮对照品溶液。

1.3 色谱条件

采用顶空进样器使用DB-624 毛细管色谱柱（Agilent Technologies），载气为高纯氮气，色谱柱流量为3.00 ml/min，分流比为10∶1。起始柱温为40℃，保持2 min；以5℃/min 升温至80℃，保持4 min；以20℃/min 升温至200℃，保持2 min。检测器温度为240℃。恒温炉温度为80℃、平衡时间为30 min。

2 方法与结果

2.1 系统适用性试验

取21 μg/ml 乙醇、28 μg/ml 丙酮对照品溶液5份，每份2 ml 置20 ml 顶空瓶中。按照“1.3”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。乙醇峰、丙酮峰的理论板数均≥5 000，乙醇峰、丙酮峰分别与其相邻色谱峰的分离度均≥1.5，符合《中华人民共和国药典》[25]四部留溶剂测定法的要求。

2.2 专属性

肺炎球菌精制多糖制备过程中按照特定比例使用苯酚抽提去除蛋白质，经过离心剩余苯酚量最大≤10%，再经过超滤过程基本能将苯酚去除[26]。分别配制一定浓度乙醇溶液和丙酮溶液，并配制为乙醇含10%苯酚的溶液、丙酮含10%苯酚的溶液、6B 型肺炎球菌精制多糖含10%苯酚的溶液。分别取乙醇溶液、丙酮溶液、6B 型肺炎球菌精制多糖溶液、苯酚、乙醇含10%苯酚的溶液、丙酮含10%苯酚的溶液、6B 型肺炎球菌精制多糖含10%苯酚的溶液2 ml 置20 ml 顶空瓶中，按照“1.3”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。乙醇保留时间约为2.413 min、丙酮保留时间约为2.794 min、苯酚保留时间约为18.776 min，且所有峰均达到分离，分离度应＞1.5。见图1。苯酚的保留时间远大于乙醇、丙酮的保留时间，提示，苯酚对乙醇、丙酮残留量检测无干扰。

图1 气相色谱图

2.3 检测限（limit of detection，LOD）与定量限（limit of quantitation，LOQ）

先分别配制10 μg/ml 乙醇溶液和10 μg/ml 丙酮溶液，再采用逐步稀释法将其分别稀释到0.596、0.199、0.152、0.051 μg/ml。按照“1.3”项下色谱条件进行检测，以信噪比3∶1 作为LOD；以信噪比10∶1 作为LOQ[25]。在该方法条件下，乙醇的LOD 为0.199 μg/ml，LOQ 为0.596 μg/ml；丙酮的LOD 为0.051 μg/ml，LOQ 为0.152 μg/ml。

2.4 线性范围

将“1.2.2”中对照品贮备液用纯化水分别稀释乙醇浓度为0.090、3.000、12.000、21.000、30.000 μg/ml的溶液，丙酮浓度为0.120、4.000、16.000、28.000、40.000 μg/ml 的溶液，按“1.3”项下色谱条件进行检测，结果显示乙醇的线性方程式为Y=2 276.471 86X-265.405 07，相关系数r=0.999 99，线性范围为0.090～30.000 μg/ml，表明乙醇对照品色谱峰峰面积与其浓度呈线性关系，乙醇标准曲线见图2；丙酮的线性方程式为Y=7790.898 42X+4 216.806 23，相关系数r=0.998 13，线性范围为0.120～40.000 μg/ml，表明丙酮对照品色谱峰峰面积与浓度呈线性关系，丙酮标准曲线见图3。

图2 乙醇线性范围标准曲线

图3 丙酮线性范围标准曲线

2.5 准确度

取6B 型肺炎球菌精制多糖溶液4 ml 置离心管中，共12 份。其中3 份分别加纯化水6 ml。剩余9 份，分成3 组，每组分别量取2 100 μg/ml 乙醇、2 800 μg/ml丙酮对照品贮备液0.050、0.100、0.150 ml，再分别加纯化水5.950、5.900、5.850 ml。考察供试品低、中、高3个浓度的加标回收率。每份2 ml 置20 ml 顶空瓶中，按照“1.3”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。

供试品低、中、高3 个浓度的加标回收率乙醇为86.20%～100.66%，丙酮82.89%～91.42%；RSD 乙醇为1.88%～6.44%，丙酮为3.84%～4.50%。见表1。表明在该检测条件下乙醇、丙酮准确度较高，则系统误差较小。计算公式为：回收率（%）=（测定值-初始值）/加入量×100。

表1 6B 型肺炎球菌精制多糖溶液准确度结果

2.6 重复性

取6B 型肺炎球菌精制多糖溶液6 份，每份取2 ml置20 ml 顶空瓶中，按照“1.3”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。在相同条件下，由同一人对6B 型肺炎球菌精制多糖溶液试验6 次，供试品RSD 乙醇为2.3%，丙酮为5.5%。表明在同一条件下，采用该检测方法乙醇、丙酮残留量重复性良好。

2.7 重现性

在不同时间，由甲、乙、丙3 人对6B 型肺炎球菌精制多糖溶液共试验3 次，供试品RSD 乙醇为7.2%，丙酮为4.2%。表明不同时间，不同人员检测乙醇、丙酮残留量重现性良好。

2.8 样品测定

取9 批6B 型肺炎球菌精制多糖按照仪器与试药中的“1.3”色谱条件进行乙醇、丙酮残留量检测。测定结果见表2。表明6B 型肺炎球菌精制多糖乙醇、丙酮残留量均较低。

表2 6B 型肺炎球菌精制多糖测定结果

3 讨论

乙醇的沸点为78.3℃，易溶于水；丙酮的沸点为56.5℃，易溶于水。因此可采用水溶解样品，同时使用气相色谱法进行乙醇、丙酮的检测。由于6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮含量很低，因此采用顶空气相色谱法检测乙醇、丙酮残留量。

本研究结果表明，乙醇、丙酮理论板数≥5 000，分离度≥1.5，表明各组分可得到较好的分离，系统的适用性良好；苯酚对6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮残留量检测没有干扰；乙醇的LOD 为0.199 μg/ml，LOQ 为0.596 μg/ml；丙酮的LOD 为0.051 μg/ml，LOQ为0.152 μg/ml，表明在定量限以上能定量测定乙醇、丙酮的残留量。6B 型肺炎球菌精制多糖对低、中、高3 个浓度加标回收法测得回收率乙醇为86.20%～100.66%，丙酮为82.89%～91.42%，表明该方法具有良好的准确性。重复性RSD 乙醇为2.3%，丙酮为5.5%，表明该方法具有良好的重复性；重现性RSD 乙醇为7.2%，丙酮为4.2%，表明该方法具有良好的重现性；乙醇的线性回归方程式为Y=2 276.471 86X-265.40507，相关系数r=0.999 99，线性范围为0.090～30.000 μg/ml，表明乙醇对照品色谱峰面积与浓度呈线性关系；丙酮的线性回归方程式为Y=7 790.898 42X+4 216.806 23，相关系数r=0.998 13，线性范围为0.120～40.000 μg/ml，表明丙酮对照品色谱峰面积与浓度呈线性关系。

因此，使用该方法检测6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮的残留量结果可靠、操作方便。可用于6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮的残留量。