燕窝真伪鉴别研究进展综述

邱爽 ，张新科，孔文茹，王姝麒，王东亮

1.北京小仙炖生物科技有限公司（北京 100020）；2.河北省燕窝鲜炖技术创新中心（廊坊 065700）；3.山东大学药学院（济南 250012）

燕窝（Edible Bird’s Nest，EBN）原产于东南亚，是由雨燕科金丝燕属（Aerodramus）、侏金丝燕属（Collocalia）和雨燕属（Apus）在繁殖季节分泌的唾液与羽毛、草等混合，粘合在墙壁或者洞穴上而铸成的“育儿床”，用于产卵及孵育雏燕[1]。能够产燕窝的金丝燕主要分布在印度尼西亚、马来西亚、泰国、缅甸、越南、菲律宾、柬埔寨和中国南部[2]。印度尼西亚生态环境适宜，燕屋应用成功，是全球最大的燕窝输出国，年产量约为全球的85%。

燕窝性平味甘，归肺经、胃经、肾经，在我国历史悠久，早在明代就有燕窝记载。现代研究发现燕窝含有丰富的蛋白质、氨基酸、唾液酸和微量元素等[3-4]，具有抗病毒、抗氧化、抗神经退行性疾病及皮肤保护等多种生物功能[5-6]。中国是世界上最大的燕窝消费国，也是每年全球最大的燕窝进口国。仅2021年1月至6月，中国从印尼和马来进口了约170 t燕窝[2]。燕窝行业附加值高，供小于求，1 kg燕窝在我国的售价高达6 000美元，不少商家通过掺假来牟取高额利润，以次充好现象更是屡屡发生[7]。消费者们并不能很好地对燕窝真伪及是否掺假进行鉴别。建立一套高效、便捷、准确的燕窝真伪鉴定方法一直是燕窝行业的一大难题。针对目前国内外燕窝掺假方式及真伪鉴别方法进行了汇总，为后续燕窝真伪鉴别研究提供一定的参考。

1 目前燕窝常见的掺假方法

燕窝掺假分为完全造假和部分掺假两种情况。前者是产品中完全不含有燕窝，将琼脂、鱼鳔、卡拉胶、猪皮、银耳等掺假物与调和剂混合制成；后者制成的产品中含有燕窝，为了提高产品重量、风味、口感或卖相，在燕窝中混入琼脂、银耳、猪皮、蛋清、葡萄糖、卡拉胶等[7-9]。燕窝常见掺假物分为两类。第一类为鱼鳔、猪皮、卡拉胶、珊瑚粉、琼脂和银耳等固体，它们附着在燕窝表面，可以利用显微镜观察到表面结构的差异。第二种是水溶性物质，如糖类（葡萄糖、蔗糖）、多肽（水解胶原蛋白）和盐，在干燥时很容易被燕窝内部吸附形成复合物，使其难以目视检测[7]。

除了人为掺假外，还有许多商家为了牟取高额利润，混淆燕窝产区、品种以及生产方式。人们认为天然洞燕的营养价值高于屋燕，燕窝市场便出现了大量将白燕熏制染色成血燕的现象，特别是2011年发生的“血燕”事件，此次食品安全事件的根本原因就是不法商家采购便宜的白燕窝熏制、发酵、染色加工成血燕，这给燕窝行业带来了严重打击，直到近年才有所恢复[10]。

燕窝掺假事件层出不穷，燕窝行业良莠不齐，使得消费者对燕窝产生信任危机。多数消费者难以对燕窝真伪进行鉴别，开发有效、快速的燕窝真伪鉴别方法一直是重要的研究课题。

2 燕窝真伪鉴别检测方法

2.1 遗传学方法

蛋白质分析和DNA分析是食品溯源和真实性分析最常见的方法。DNA比许多蛋白质耐热，稳定性高，这使其成为区分和鉴定食品成分的首选分子。

在燕窝真伪以及燕窝基源鉴别中，针对特定核酸序列鉴定可以提高检测的准确度，常见的有线粒体细胞色素b（Cytb）基因和NADH脱氢酶亚基2（ND2）基因。Lin等[11]基于Cytb基因序列，构建了用于燕窝样本遗传鉴定的系统发育树。何国林等[12]设计了一条特异靶向Taq Man探针，通过鉴定金丝燕属与雨燕属Cytb基因进行燕窝的真伪鉴别。在该类研究中，DNA的提取效率是实验的关键，研究表明异硫氰酸胍法是燕窝DNA的最佳提取方法[13]，特定序列的检测降低了全基因检测中可能出现的假阳性误差。DNA分析用于燕窝真伪鉴别更准确，可实现燕窝的相对定量。然而DNA技术操作繁琐，应用于燕窝流通中的真伪鉴别还存在一定的局限。

2.2 酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA具有免疫反应的特异性和酶标记物检测的高敏度双重优势。猪明胶是食用燕窝中的常见掺假物，为了快速检测燕窝中的猪明胶，研究针对猪种特异性氨基酸序列的α2 Ⅰ型胶原（pAb 1、pAb 2）与α1 Ⅰ型胶原（pAb 3）链建立了竞争性间接ELISA反应，该技术能够检测到样品中至少0.05%的猪明胶[14]。对比3种ELISA反应，pAb 3链反应稳定且未与蛋清发生交叉反应，更适合于燕窝中猪明胶的检测[15]。除了设计掺假物的特异性抗体外，还可以针对燕窝特定成分进行ELISA反应。唾液酸糖蛋白是燕窝中唾液酸的主要载体，由106和128 kda蛋白组成。Zhang等[16-17]利用夹心ELISA法制备了两种抗特征性唾液酸糖蛋白单克隆抗体，并用Western印迹法检测，优化后的ELISA条件IC50仅为1.5 ng/mL。ELISA的特异性强，但受到掺假物种类的限制，针对不同的燕窝掺假物需筛选制备出不同的抗体。

2.3 光谱法

燕窝中的唾液酸与酸性茚三酮能形成稳定物质，利用紫外光谱法（Ultraviolet Spectrophotometry，UV）检测时在470 nm处有最大吸收峰[18]。对于燕窝本身来说，真品燕窝在280 nm处有最大紫外吸收，而伪品无最大吸收峰[19]。核磁共振技术操作简便、普适性高、异构体分析能力强。高志亮[20]对比了燕窝及掺假物的1H-NMR谱图，结果发现假燕窝在化学位移δ3.4~4.0未检测到与唾液酸相似的共振峰，而真品燕窝能检测到。然而单从指定成分的光谱结果衡量燕窝真伪并不准确，更不能对掺假物的种类和含量做出准确的判别。扩大样本量结合化学计量学建模是提高准确度的重要手段。Shi等[21]利用近红外光谱和化学计量学建立了一种快速、简单的燕窝真伪及分级认证方法。研究从印尼、马来和泰国共收集了80多种燕窝，制备了200个掺假燕窝，利用化学计量学提取与燕窝品质相关的光谱特征，基于这些光谱特征建立的模型对燕窝真伪、质量分级的识别率可达到90%以上，该方法通过扩大样本量和来源建立了一套较为准确的鉴别模型。

在光谱相关的鉴别方法上，傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）技术应用于燕窝真伪鉴别在不断发展。早在2001年，孙素琴等[22]首次将钻石ATR探头FTIR技术应用于燕窝鉴别，研究发现各个燕窝红外谱图的峰形相似，但部分营养成分吸收峰的强度和位置存在差异，特别是蛋白质、氨基酸和多糖。后续的研究大多利用燕窝及掺假物的FTIR谱图、特征峰进行分析建模[23]，然而此类模型在掺假物含量较低时判别不准确[8]。

除了燕窝真伪鉴别外，光谱法还可用于血燕的区分。Cheng等[24]通过1H-NMR技术发现燕窝熏制后苯环发生改变，并将燕窝人工硝化过程中SERS指纹图谱的变化归因于氨基酸残基的结构改变[25]，这些研究证明了燕窝熏制过程导致氨基酸序列改变，从本质上实现了对天然血燕和人工熏制血燕的识别。

相比于遗传学和蛋白学，光谱技术样品前处理和操作更简单，通过扩大样本量联合化学计量学可以建立一套较为稳定的燕窝真伪鉴别模型。然而该方法无法实现掺假物的定量，对于一些未知掺假原料不能做出准确的判断，精准度不如其他鉴别方法。

2.4 色谱法

利用色谱技术进行燕窝真伪鉴别多集中在对特定成分定性或定量来区分燕窝中是否含有掺假物。燕窝中单糖组成是燕窝真伪鉴别的重要指标，Tung等[26]采用高效离子交换色谱-脉冲安培检测器（High-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）进行糖谱分析，最终将唾液酸相对含量（10.8%±0.76%）作为评估燕窝含量的指标。此外，真正的燕窝含有甘露糖、半乳糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸，而多数假冒品不含[27]。利用气质联机（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、气象色谱（Gas chromatography，GC）检测燕窝中挥发性成分、氨基酸、脂肪酸组成也被用于燕窝真伪鉴别、产区溯源以及加工工艺的区分[28-30]。

除单糖组成外，唾液酸含量也是鉴别燕窝真伪、衡量品质好坏的重要指标，液相色谱是检测唾液酸最常用的方法。不同品种燕窝中唾液酸含量具有差异，如白燕中唾液酸含量为13%，血燕中为10%，而银耳、猪皮、琼脂等常见伪品中不含唾液酸[31-32]。唾液酸含量也可以用作燕窝等级划分的标准，唾液酸含量在10%以上为A级燕窝，7%~10%为B级，5%~7%为C级[21]。该方法在一定程度上可以区分燕窝及掺有银耳、猪皮等成分的掺假燕窝，然而市场上还有商家直接向燕窝中添加唾液酸或其他含有唾液酸的原料，在此类产品的检测中以唾液酸为基准的鉴别方法便不准确。此外，现有研究中多认为唾液酸是燕窝的核心营养成分，但唾液酸只占燕窝的10%左右，只以唾液酸含量作为燕窝分级的标准过于片面。在燕窝的营养成分中，50%以上均为蛋白质，特征蛋白或肽段的筛选将成为燕窝真伪鉴别及分级的重要方向。

基于以上研究方向，Wu等[33]筛选出了13个标记肽段用于区分白燕和草燕/掺假物，3个肽段区分草燕与白燕/掺杂物。特异性肽段的筛选可实现掺假物或燕窝的定量。Ma等[34]筛选出了9种来自掺杂物的特征肽段用于掺杂物的定量分析。类似的方法也被用来定量燕窝产品中琼脂的含量，琼脂是燕窝常见掺杂物，因其不吸收紫外，很难对燕窝中琼脂含量进行检测。Cheng等[35]开发了一种子寡糖标记法对琼脂进行定性定量。研究利用LC-QTOF-MS检测发现新琼四糖信号丰度高且与标准琼脂线性关系好，被选为检测标记用于定性和定量分析，这种低聚物标记法可用于燕窝原料中掺有琼脂产品的质量控制，而且可以定量分析[35]。基于色谱检测的蛋白质分析方法不仅可以准确地对燕窝及掺假物进行判别，重要的是可实现产品中燕窝及掺假物的定量，具有广阔的发展前景。

2.5 凝胶电泳法

凝胶电泳常用于蛋白质分析，典型的有聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）和双向电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）。燕窝往往被加工成长梭形、球形，如白燕条、宫燕饼、草燕等。早在1999年，胡珊梅等[36]就利用PAGE对燕窝及燕窝加工品进行区分，研究通过各实验样品在电泳图谱上谱带的条数以及深浅进行鉴别，证实了该方法区分燕窝及加工品的可行性。真燕窝比猪皮、琼脂等燕窝伪品的特征图谱更明显，蛋白质种类更多[31]。

电泳技术也被用于燕窝产地及生产方式的区分，郭丽丽[8]采集了来自印尼和马来的已知生产方式和产区的燕窝，利用蛋白条带数和相对含量建立了产区和生产方式的判别模型，采用2-DE筛选出了不同生产方式和产地的燕窝差异蛋白点，为后续的质谱分析提供一定的参考。SDS-PAGE结合多变量分析是鉴别燕窝地理来源和生产方式的一种可行方法，然而该方法的检测精度受到建模时实验样本数量和覆盖率大小的影响，应通过扩大样本量和样本来源以验证鉴别模型的稳定性[37]。

2.6 其他方法

除上述方法外，还有一部分研究利用氨基酸分析仪、传感器阵列、同位素等方法进行燕窝真伪鉴别。不同燕窝样品以及掺假物在氨基酸组成和含量上都存在差异，如真品燕窝中不含羟脯氨酸和胱氨酸，伪品在氨基酸组成上和燕窝均不相同[38]。Eric等[39]首次将热重分析（Thermogravimetry，TG）、微分热重（Differential thermogravimetry，DTG）和差示扫描量热分析（Differential scanning calorimetry，DSC）用于燕窝的快速鉴别。燕窝独特的热重分析和微分热重分析曲线可作为燕窝真伪分析标准，该方法只需5~10 mg样品，无需样品预处理即可检查燕窝中是否含有掺假物。

表1 燕窝真伪鉴别技术的应用

Huang等[29]开发了一种由比色传感器阵列、智能手机和多层网络模型构成的低成本智能系统鉴别和定量掺假燕窝，通过收集燕窝的挥发性成分特征和响应信号，利用智能手机获取图像，该系统提供了一个实时、可靠的预测模型。随后该团队用同样的方法识别燕窝的地理来源，使用PCA、HCA和聚类分析研究样本组之间的相似性，该设备能够识别未知燕窝的地理来源[40]。该技术特异性强，但同样受到样本量和样品来源的影响，且并未实现掺假物的定量。

3 结语与展望

燕窝具有众多保健功效，一直被认为是名贵的滋补品。然而，目前燕窝行业没有规范的真伪鉴别标准，燕窝产品鱼龙混杂，掺假现象频频发生，一直是燕窝行业的一大难题。此研究对燕窝常见的掺假物进行汇总，从遗传学、ELISA、光谱学、色谱学、凝胶电泳学方向归纳了燕窝的真伪鉴别方法，并讨论了每种方法的优缺点，为燕窝行业质量监控体系提供参考。

基因和蛋白层面的燕窝真伪鉴别比光谱法以及色谱法中特定成分的检测更准确，然而金丝燕的基因、蛋白数据库不完善，现有研究中燕窝的蛋白和肽段数据大部分不具有系统性[33]，急需补充金丝燕及燕窝数据库，找到真正的差异基因或蛋白。燕窝真伪鉴别常涉及专业仪器和方法，且需要一定的样品前处理，不利于在进口或商品流通环节推广。后续还需要开发准确、快捷的燕窝真伪鉴别方法，将其与成熟的计量学分析手段结合，适合于流通环节的使用。

此外，燕窝造假事件导致的食品安全问题不容忽视。许多生产商为了延长即食燕窝的保质期，使用次氯酸盐漂白燕窝，抑制细菌生长。该过程会形成氨基脲，危害消费者的健康[47]。然而目前对漂白燕窝的鉴别方法十分有限，大多仅从味觉以及触觉等感官层面上区分，没有准确的衡量标准，仍需要更深入的研究。