螺蛳蛋白美拉德反应产物活性的研究

黎海彬 ，罗岸峰，刘勃，潘宁，黄永春，宋贤良

1.广东雅和生物科技有限公司（清远 530000）；2.广西沪桂食品集团有限公司（柳州 545000）；3.广西科技大学（柳州 545000）；4.华南农业大学（广州 510642）

在食品加工工业中，食品中的主要营养成分有蛋白质、多糖等大分子物质，而蛋白质、多糖中含有美拉德（Maillard）反应需要的羰基与氨基，同时食品原料经过热处理过程，食品一般就会发生Maillard反应，结果会给食品带来良好的色泽与风味。在食品工业领域，肉类调味基料就是采用蛋白质及其肽类物质进行美拉德反应制备。通过美拉德反应获得的蛋白肽对食品风味及食品的生物活性有良好作用。对于大分子蛋白质来说，不同肽链的长度、肽的氨基酸组成成分和氨基酸序列甚至肽键的水解度都会对美拉德反应产物的风味和生物活性产生特定的影响，而特殊风味物质的形成、对原材料风味的改善都可以通过特有的Maillard反应获得[1-3]。

通过Maillard反应改善食品原料风味的不足，生成特殊风味的物质，该技术在食品调味料的制备以及食品风味的改善中都有很多的研究。在食品香精香料的制造以及食品调味基料的制造过程中[4-7]，为增加食品的风味，改良食品的品质结构，往往通过呈味的小分子肽类物质参加反应，从而形成很好的色、香、味的食品。作为广西柳州特色小吃，螺蛳汤料直接影响螺蛳粉的风味及营养，制备具有营养功能螺蛳粉调味汤料的研究尚未见报道[8-10]。试验以螺蛳为主要原料，通过生物技术手段制备的小分子鲜味肽具有呈味、抗氧化、提高免疫力等功能，可被广泛应用于保健品、食品等营养与健康产业，以鲜味肽为主要原料开发出的螺蛳粉调味汤料，既增加产品风味，又具有营养保健功能，对螺蛳粉产业的发展起到促进作用[11-12]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

螺蛳蛋白酶解液：螺蛳洗干净，测定螺肉的主要成分；生物酶解螺蛳蛋白，料液比1︰2.5（g/mL），酶解pH 6.5，酶解温度55 ℃，酶解时间6.5 h，采用复合蛋白酶（3 000 U/g）酶解，在93 ℃下灭酶，保持6 min，离心7 min（5 700 r/min），上清液为螺蛳蛋白酶解液，备用。

螺蛳蛋白酶解液美拉德（Maillard）反应物（实验室制备）。

盐酸、氢氧化钠、硫酸亚铁、氯化亚铁、乙醇（分析纯，广东广试试剂科技有限公司）；水杨酸、过氧化氢（分析纯，广州天一实验材料有限公司）；菲啰嗪、DPPH（生化试剂，广州天普生化医药有限公司）；葡萄糖、木糖、果糖（均为食品级，广东焕发生物科技有限公司）。

DL03电子分析天平（上海赞维衡器有限公司）；001D pH计（上海一恒科技有限公司）；DG18-TS高速离心机（广州吉迪仪器有限公司）；HRD-4电热恒温水浴锅（上海雅程实验设备有限公司）；Agilent7890A-5975C气相色谱-质谱仪[安捷伦科技（中国）有限公司]；TU-3200紫外分光光度计（北京普析通用实验设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 螺蛳蛋白酶解液Maillard反应产物的制备

根据影响Maillard反应的几个因素，在螺蛳蛋白酶解液中加入相关的反应物，用保鲜膜、牛皮纸包好密封后放入热反应容器中，按照设定的条件完成Maillard反应，反应完成后，冷却保存。

1.2.2 Maillard反应产物抗氧化活性的研究

1.2.2.1 测定清除羟自由基的能力[13]

将2.0 mL 4.5 mmol/L乙醇-水杨酸溶液和2.0 mL 4.5 mmol/L FeSO4溶液在试管中混匀，加入2.0 mL样品和2.0 mL 5 mmol/L H2O2溶液混匀，在38 ℃水浴25 min，蒸馏水作为对照，在520 nm波长处测定吸光度。羟自由基清除率按式（1）计算。

式中：P为羟自由基清除率，%；A0为加入蒸馏水时的吸光度；Ax为加入测试样品后的吸光度；Ax0为未加入显色剂时的吸光度。

1.2.2.2 分析研究Fe3+螯合的能力

测定Maillard反应产物对Fe3+螯合的能力[14]。将0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪、0.1 mL 2 mmol/L FeCl3及3.5 mL蒸馏水与1.0 mL稀释10倍的样品混匀，在35 ℃水浴15 min后，在550 nm波长处测定吸光度AS。待测样品的吸光度记为AC，1.0 mL蒸馏水作为空白对照，记为ASB。Fe3+螯合能力按式（2）计算。

式中：ASB为对照物的吸光度；AC为加入待测样品后的吸光度；AS为加入标准样品后的吸光度。

1.2.2.3 酶解液中DPPH自由基清除能力的分析研究

测定螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后产物对DPPH自由基清除能力[15]。将3.8 mL 0.1 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液中加入0.2 mL样品，混匀后35 min，在530 nm波长处测定吸光度。DPPH自由基清除率按式（3）计算。

式中：A0为空白试样DPPH 95%乙醇溶液的吸光度；Ai为样品与DPPH 95%乙醇溶液混合后的吸光度。

1.2.2.4 Maillard反应产物的总抗氧化活性测定

测定螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后产物的总抗氧化活性[16]。在2.5 mL 1% FeCl3溶液、2.5 mL 0.02 mmol/L pH 6.6 PBS溶液中加入1.0 mL样品，混匀，于55℃水浴15 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸（TCA），混匀，从中取2.5 mL加入0.5 mL 1% FeCl3溶液与2.5 mL蒸馏水，在25 ℃下反应15 min，在710 nm波长处测定吸光度。

1.2.3 螺蛳蛋白酶解液Maillard反应后产物中主要风味物质的分析研究

对螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后产物中主要风味物质采用气质联用分析技术（GC-MS）[17-18]，分析测定其Maillard反应前后的主要挥发性风味物质的变化。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS分析

螺蛳蛋白酶解液Maillard反应前后，溶于醚类的挥发性物质组分及其相对含量的试验结果见表1与表2。结果表明，在螺蛳肉蛋白酶解中检出29种物质，分别是6种烷烃类物质、3种物质、1种物质、4种醇类物质、5种物质、2种物质和8种酸类物质；分析试验结果还可以看出，螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后产物中先后检出35种化合物，分别是3种烷烃类物质、2种酰胺类物质、3种吡嗪类物质、2种酚类物质、3种醇类物质、5种酸类物质、8种酮类物质、2种酯类物质和7种醛类物质（见表2）。结果表明，试样的挥发性组分大幅增加的主要原因是进行Maillard反应。

表1 螺蛳蛋白酶解液中挥发性物质的分析

表2 螺螺蛋白酶解液在Maillard反应后产物中风味物质的分析

酸类化合物中苯甲酸在螺肉蛋白酶解液Maillard反应产物中有较高的相对含量。有文献报道，苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸等必需氨基酸可以经过生物代谢产生芳香化合物[18-20]；苯丙氨酸的微生物降解及氧化苯甲醛都能产生苯甲酸。苯甲酸有相关的抗菌活性，如对各种细菌、酵母及霉菌具有明显抗菌功能，对保质期的延长有很大作用。阈值相对高的酸类物质对风味的产生影响不大，可是有相当的辅助作用。吡嗪类化合物因有较低阈值，在Maillard反应过程中，不同的还原糖及不同的pH可能影响到吡嗪类化合物的产生，呈现出螺蛳特有气味与香气，对螺蛳蛋白酶解液Maillard反应有很大的增强香气的作用。对于阈值低的醛类化合物，在螺蛳蛋白酶解液Maillard反应后，醛类化合物的含量增加，从0提高到8.15%，使酶解液产生很好的风味和气味。3-辛醇是属于挥发性的醇类，稍带瓜味[20]，有高含量。酯类物质是醇类物质与羧酸类物质发生酯化反应的产物，能够对螺蛳蛋白酶解液的香味和气味起到改进和增强作用，因此，能带给食品多种香味[18]。

2.2 螺蛳蛋白酶解液Maillard反应产物抗氧化活性的研究

功能性调味料是具有抗氧化活性的食品风味配料。主要研究螺蛳蛋白酶解液Maillard反应产物的抗氧化功能活性，通过以螺蛳蛋白酶解液原液与质量分数1.56%的葡萄糖溶液作为对照物进行研究。

2.2.1 DPPH自由基清除率的研究

波长517 nm时，DPPH自由基醇溶液有强的吸收，使用紫外分光光度法测定吸光度以反映褪色程度，其化学原理就是当能清除自由基的物质存在于溶液中时，溶液的颜色会慢慢褪去，可以反映出DPPH自由基的清除能力。图1是螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应前、螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后及1.56%的葡萄糖溶液经过几种倍数的稀释对DPPH自由基清除能力的结果。从图1可以看出，这几种试样对DPPH自由基清除率会随着螺蛳蛋白酶解液原液稀释倍数的提高而慢慢减少，螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应前对DPPH自由基清除能力较小，其清除率为37.50%，而1.56%的葡萄糖溶液对DPPH自由基清除能力比前者大，其清除率为50.50%，但是螺蛳蛋白酶解Maillard反应液的最大DPPH自由基清除率是81.50%。试验结果说明，螺蛳蛋白酶解液经Maillard反应后，可对DPPH自由基有较大清除能力。

图1 DPPH自由基清除率与稀释倍数的关系

2.2.2 Fe3+螯合能力的分析研究

一般情况下，有金属螯合能力的物质会有某些特定的抗氧化活性，主要因为它们有Fenton反应的产生，而在金属离子被螯合时会对产生自由基的反应有一定限制。化学反应的原理是：络合反应会在Fe3+与菲洛嗪试剂中产生，该反应会产生有色物质而帮助分析物质的变化情况，化合物只要和Fe3+螯合完全，溶液的吸光度就发生改变，要反映待测物质与Fe3+螯合能力的程度，可使用紫外分光光度法测定溶液的吸光度，采用吸光度的数据测定Fe3+螯合能力的大小。螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应前、螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后及1.56%的葡萄糖溶液经过几种倍数的稀释对Fe3+螯合能力的大小结果见图2。结果表明，螺蛳蛋白酶解原液和螺蛳蛋白美拉德反应液对Fe3+螯合能力的大小随着稀释倍数的增加而不断减小，螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应前对Fe3+螯合能力较小，其峰值是20.02%，螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后对Fe3+螯合能力较大，其峰值是45.03%。这说明对金属的螯合能力，可通过设计特定的Maillard反应来提高其对金属的螯合能力，同时也使其抗氧化功能活性提高。

图2 Fe3+离子螯合能力与倍数稀释的关系

2.2.3 总抗氧化活性的分析研究

评价溶液中抗氧化能力，主要是考察其总抗氧化活性，包括系统中的酶类和非酶类物质的抗氧化功能的叠加[19-20]。图3是螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应前、螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后及1.56%的葡萄糖溶液经过几种倍数的稀释总抗氧化功能活性的分析研究结果。结果表明，螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应前、螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后及1.56%的葡萄糖溶液经过几种倍数的稀释这几种溶液都拥有某些特定的功能活性，螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后的抗氧化功能活性峰值是0.751，可能是含硫、氮之类的物质在一定的温度下形成的缘故。

2.2.4 对羟自由基清除能力的分析研究

能够生成稳定的化合物同时停止其自身的氧化反应的是一些拥有清除羟自由基能力的化合物[20]。图4是螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应前、螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后及1.56%的葡萄糖溶液经过几种倍数的稀释对羟自由基清除率的分析研究结果。结果表明，螺蛳蛋白Maillard反应液对羟自由基清除率的峰值是76.01%，螺蛳蛋白酶解原液及1.56%葡萄糖溶液对羟自由基的清除率的峰值分别是29.01%和54.50%，这可能与能提供氢质子的物质在螺蛳蛋白酶解液中的数量极少有一定关系。

图4 羟自由基清除率与稀释倍数的关系

3 结论

使用GC-MS对Maillard反应产生的风味物质进行分析和研究，结果表明，具有挥发性风味物质的酶解液，其主要成分和含量在Maillard反应前后会有很大不同。特别是产生多种对风味有很大影响的有机化合物，如醛类、吡嗪、酮类及酯类化合物，分析检测出35种化合物是通过螺肉蛋白Maillard反应产生的。

螺蛳蛋白Maillard反应液具有一定抗氧化功能活性，选用最佳工艺条件下制得的Maillard反应液作为研究对象，结果表明：螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后的产物对羟自由基的清除率的峰值是76.01%，对DPPH自由基清除率的峰值是81.50%，对Fe3+的螯合能力的峰值是50.01%，说明拥有强抗氧化功能活性的是螺蛳蛋白酶解液在Maillard反应后的产物，Maillard反应后的产物总抗氧化功能活性最强，反应产物吸光度的峰值是0.751，显著超过对照组。