免疫检查点分子在妊娠中的研究进展

王艺绚，连 方，庞聪慧，于晓娜，官 璐

（1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属中西医结合生殖与遗传中心，山东 济南 250014）

免疫检查点分子是在多种免疫细胞表面观察到的共抑制受体，与特异性配体结合后，这些分子能够转导抑制信号到细胞内负性调节免疫反应。细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白（CTLA‐4）、程序性细胞死亡蛋白（PD‐1）、T 细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域蛋白‐3（Tim‐3）是目前被研究最多的免疫检查点分子，它们的基本生理功能是通过负性调节免疫细胞，抑制免疫细胞介导的炎症反应，来防止免疫系统过度激活。因此，这些分子能够在诱导移植耐受、肿瘤免疫逃逸和预防自身免疫等方面发挥重大作用。

正常胚胎不被母体所排斥，且被允许在子宫内生长发育直至分娩，这有赖于母胎界面微妙的免疫调节。免疫检查点分子广泛存在于母胎界面，诱导母体产生免疫耐受，减弱免疫排斥反应。这些分子的缺失或失调可能会干扰母体‐胎儿之间的对话，引发免疫失衡，进而导致妊娠丢失或其他妊娠并发症的发生。本文就目前主要免疫检查点分子在妊娠中的免疫调节作用作一综述，以帮助评估其在妊娠和妊娠并发症中的潜在效用。

1 CTLA-4

CTLA‐4 是最早被发现的免疫检查点受体，主要在调节性T 细胞（Tregs 细胞）中作为细胞内蛋白组成性表达。活化后，CTLA‐4 在Tregs 细胞表面表达，也在CD4+或CD8+T 细胞的表面被发现。CTLA‐4 的主要抑制作用在于它以比T 细胞活化受体CD28 高十倍的亲和力竞争结合存在于抗原提呈细胞表面（APCs）的B7 配体CD80/CD86，进而抑制T 细胞增殖、细胞周期进程和T 细胞分化等［1］。此外，CTLA‐4 通过与CD80/CD86 结合诱导APCs 表达吲哚胺2，3‐双加氧酶（IDO）的能力也被认为是其增强T 细胞免疫抑制的重要机制［2］。

1.1 CTLA‐4 在妊娠中的作用

在流产倾向鼠交配的母胎界面CTLA‐4 表达显著降低，用抗CD80 和抗CD86 mAb 阻断CD28/B7 途径可将CD4+脾T 细胞中细胞因子从Th1 优势转移到对妊娠有益的Th2 优势并扩展外周Tregs细胞群体以及增强CTLA‐4 的表达，进而降低胎鼠的 丢 失 率［3］。阻 止CD80/CD86 与CD28 的 结 合 被认为是CTLA‐4 免疫抑制作用的经典方式，因此其在提高母胎耐受中可能具有相似作用。CTLA‐4Ig融合蛋白实验为CTLA‐4 的免疫抑制能力提供了进一步证据。CTLA‐4Ig 扩大了易流产小鼠模型的外周Tregs 细胞群体，下调Th17 细胞的表达，也使血清和胎盘组织培养上清液中的细胞因子水平向Th2 偏移，并诱导了母胎界面上IDO 和Tregs 的主要调节因子叉状头转录因子3 的表达，改善小鼠的妊 娠 结 局［4］。腺 病 毒 介 导 的 CTLA4Ig 转 基 因（Ad‐CTLA4Ig）治疗也可通过抑制小鼠母体脾淋巴细胞的增殖和调节胎盘单位的凋亡来改善自然流产的结果［5］。

在人类妊娠早期，外周Tregs 细胞数量增加，但正常妊娠者和早孕期自然流产妇女外周血CD4+CD25+T 细胞内CTLA‐4 分子表达水平无显著性差异，自然流产患者外周CD28 分子的表达水平却显著高于早孕期正常妊娠者，提示人早孕期妇女外周血CD28+T 细胞降调节可能比CTLA‐4+T细胞升调节更为重要［6，7］。与外周相比，蜕膜Tregs细胞的数量进一步增加，在蜕膜Tregs 细胞中发现的CTLA‐4 表 达 的 频 率 也 有 所 增 强［8］。蜕 膜CT‐LA‐4 的表达与蜕膜Th2 细胞因子的产生呈显著正相关，与Th1 细胞因子的产生呈负相关，CTLA‐4 的高表达有助于其抑制母体对同种异体胎儿的免疫反应，并增加胎儿存活率［9.10］。然而有趣的是，Nao‐ko 等［11］发现正常妊娠者用CTLA‐4/Fc 治疗后，CT‐LA‐4 能够通过诱导产生大量的γ‐干扰素（IFN‐γ）来上调蜕膜单个核细胞中IDO 的表达，进而改善妊娠结局，但这与蜕膜中的细胞因子分布以Th2 为主导的状态所相悖。蜕膜单个核细胞包含产生IFN‐γ 的自然杀伤细胞（NK 细胞），T 细胞，NKT 细胞和树突状细胞等，因此需要进一步的研究来阐明CTLA‐4治疗后蜕膜中哪些细胞产生IFN‐γ［12］。

1.2 CTLA‐4 与妊娠并发症

与正常妊娠妇女相比，复发性流产（URSA）患者外周和蜕膜Tregs 细胞明显减少，CTLA‐4 的表达及CTLA‐4+/CD28+的比值也随之下降，母胎界面的细胞因子以Th1 型为主，导致了妊娠妇女宫腔内免疫环境失常，从而容易引起妊娠丢失。外源性给予与CTLA‐4Ig，可促进Tregs 细胞增殖，抑制Th17 细胞的发育分化，改善URSA 患者妊娠结局［13］。在基因层面，CTLA‐4 基因的多态性是复发性流产的一个重要危险因素，CTLA‐4 基因外显子1 第49 位A/G 的多态性导致了前导肽中的苏氨酸到丙氨酸的变化，引起粗面内质网蛋白修饰异常，进而增加URSA 的易感性。具有基因型AA 的细胞比基因型GG 的细胞具有更高的CTLA‐4 表达，而在URSA 人群中可检测到高频率的CTLA‐4 49 GG基因型［14，15］。

先兆子痫在免疫方面与复发性流产有着相同的机制，Tregs 细胞数量的减少以及免疫调节的偏移与子痫的发病密切相关。CTLA‐4 49A/G 等位基因中的杂合型也是重度子痫前期发病的易感基因［16］。然而，关于子痫患者外周血和蜕膜中CT‐LA‐4 表达模式的研究较少，结论缺乏一致性，也有表达模式增加和不变的报道［17，18］，因此CTLA‐4 在子痫中的发病机制还需进一步的实验研究。

2 PD-1

PD‐1 是 一 种 共 抑 制 受 体，在T 细 胞、B 细 胞、NK 细 胞、APCs 等 细 胞 上 表 达［19］。PD‐1 的 配 体PD‐L1 在组织细胞的分布具有广泛性，既可以表达于造血细胞，如B 细胞、树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，经活化后也可在血管内皮细胞、成纤维型网状细胞、星形胶质细胞等多种非造血细胞上表达［20］，而配体PD‐L2 仅在淋巴组织或慢性炎症环境中的APCs 上可检测到表达［21］。PD‐1 与PD‐L1 或PD‐L2 的结合可以使PD‐1 胞内区的两个重要结构免疫受体酪氨酸转换基序和免疫受体酪氨酸抑制基序发生磷酸化，从而传递共抑制信号，抑制细胞增殖并减弱效应子功能［22］。

2.1 PD‐1 在妊娠中的作用

PD‐1 / PD‐L1 途径在对于母胎界面免疫抑制状态的建立发挥了重要作用，并且主要体现在同种异体妊娠小鼠中，对同基因小鼠妊娠影响不显著［23］。在 鼠 妊 娠 模 型 中，PD‐L1 的 阻 断 突 显 了PD‐1 / PD‐L1 途径的功能作用。向妊娠雌性小鼠腹腔注射PD‐L1 mAb，PD‐L1 被阻断后母胎界面Tregs 细胞数减少，胚胎吸收率增加，产仔数减少［24］。将正常妊娠小鼠的Tregs 细胞过继转移到易流产模型妊娠小鼠中，易流产小鼠妊娠率提高，随后用抗PD‐L1 mAb 进行 PD‐L1 阻断取消了Tregs的保护作用，并导致小鼠流产率增加，若先前耗竭体内的Tregs 细胞，PD‐L1 的阻断则对小鼠的妊娠结局不起作用，因此PD‐1 / PD‐L1 途径对母体的免疫耐受作用可能是以Tregs 细胞为介导的［25］。此外，PD‐1 / PD‐L1 途径在Teff/Tregs 细胞平衡以及细胞因子的精细调节中也发挥了重要作用，PD‐L1的阻断抑制了抗原特异性同种异体反应性T 细胞凋亡，诱导了Tregs 细胞凋亡以及Th17 细胞向更高频率转变，胎盘中促炎性Th1 型细胞因子IFN‐γ 的表达上调，胎仔吸收率增加，中和Th17 细胞因子IL‐17 可消除抗PD‐L1mAb 对胎仔存活率的影响，并恢复Tregs 细胞数量［26］。

与非妊娠女性相比，健康妊娠女性外周血中表达PD‐1 的T 淋巴细胞频率升高，且可溶性PD‐L1水平在整个妊娠期间升高。在母胎界面，蜕膜巨噬细胞（decidual macrophage，DM）是人妊娠期子宫蜕膜最主要的专职抗原呈递细胞，PD‐L1 存在于早孕期从子宫蜕膜中分离出的DMs 上，而孕妇外周血PMs 中未检测出PD‐L1 的表达。PD‐1/PD‐L1 相互作用会对人类早期蜕膜中活化T 细胞的IFN‐γ 分泌产生负面影响。由于IFN‐γ 暴露会上调DMs 的PD‐L1，因此DMs 可以通过PD‐1/PD‐L1 途径介导的负反馈来集中控制蜕膜IFN‐γ 的水平，进而维持母胎界面免疫反应的精细调控［27］。若阻断 PD‐1/PD‐L1 信号通路，早孕期巨噬细胞向不利于妊娠的M1 型分化，巨噬细胞的吞噬功能减弱，促炎性细胞因子生成能力增强，该过程可能是通过促进细胞无氧糖酵解和抑制细胞脂肪酸氧化实现的，并且受PI3K/AKT/m‐TOR 和MEK/ERK 信号分子的调控［28］。除了固有免疫，PD‐1/PD‐L1 信号通路对获得性免疫也同样存在调控效应。妊娠期蜕膜CD3+T 淋巴细胞上PD‐L1 的表达明显高于非妊娠子宫内膜T 细胞，且与妊娠期间的外周血相比，蜕膜T 细胞上PD‐L1 的表达更为丰富。使用转染PD‐L1 的绒毛膜癌细胞与 CD4+T 在体外共同培养，发 现PD‐L1 可 以 抑 制CD4+T 细 胞 中IFN‐γ 和TNF‐α 的分泌，但对IL10 的生成却没有显着影响，表明PD‐L1 可导致蜕膜T 细胞因子的选择性抑制，而不是全局抑制［29］。此外，妊娠期母体雌激素水平的波动、胎盘的发育以及母胎血流供应中氧气浓度变化也会对PD‐1 /PD‐L1 的表达产生影响［30］。

2.2 PD‐1 与妊娠并发症

不明原因复发性流产患者外周血Th17 细胞上PD‐1 和PD‐L1 的表达以及Th1 细胞上PD‐1 的表达明显下调，Th1 和Th17 免疫反应增强，子宫内膜容受性下降［31］。淋巴细胞免疫治疗可增强外周血PD‐1 的表达，使Th1/Th2 免疫平衡向Th2 偏倚，并有利于封闭抗体的产生，进而改善URSA 患者的妊娠 结 局［32］。在 母 胎 界 面，URSA 患 者 蜕 膜 组 织 中PD‐L1 的表达降低，而PD‐1 的表达与对照组相比无明显差异，但PD‐1+的巨噬细胞比例显著降低，M1型巨噬细胞显著增加，推测PD‐1/PD‐L1 通路可能通过影响巨噬细胞极化来引起妊娠丢失的发生［33］。

子痫前期妇女的外周血sPD‐1 水平显着高于正常孕妇，表明子痫前期患者的全身免疫反应增强［34］。与正常妊娠组相比，子痫前期患者胎盘中PD‐1 和PD‐L1 表达水平显著降低，PD‐1/PD‐L1 信号通路对Th17 细胞增殖的抑制作用减弱。PD‐L1 Fc 可以通过抑制PI3K/AKT/m‐TOR 信号转导和增强磷酸酶和张力蛋白同源物表达促进外周Tregs细胞分化，为PE 患者的治疗提供了新的思路［35］。妊娠糖尿病（GDM）患者体内的免疫功能也处于紊乱状态，PD‐1 在 GDM 孕妇外周血 T 淋巴细胞中的表达水平明显低于正常妊娠组，经治疗的GDM患者血糖恢复至正常水平后PD‐1 的表达也有所增强，因此外周T 细胞上PD‐1 表达的动态变化，可以为GDM 诊断和治疗评估提供理论依据和生物标记［36］。

3 Tim-3

Tim‐3 最初被确定为Th1 特异性细胞表面分子，传递负性共刺激信号，后来在其他免疫细胞如Th17、Tregs、NK 以及NKT 样细胞表面也被发现有不同程度的表达［37］。Tim‐3 的异常表达是自身免疫性疾病、感染、移植和癌症的重要原因。半乳糖凝集 素‐9（Galectin‐9，Gal‐9）是Tim‐3 的 配 体，属 于S型半乳糖凝集素家族成员之一。因Gal‐9 在增殖期和分泌早期的表达非常低，而在分泌中期和分泌晚期（着床窗口）的表达显著增加，所以被定义为分泌中 晚 期 和 蜕 膜 期 的 子 宫 内 膜 标 志 物［38］。Gal‐9 与Tim‐3 结合后，复合物将导致Tim‐3+Th1 细胞发生无能或凋亡，该过程可能是免疫应答停止的机制之一，从而避免了具有潜在有害物质的过度炎性免疫反应［39］。

3.1 Tim‐3 在妊娠中的作用

小鼠实验表明，妊娠期子宫和外周血中均存在Tim‐3，并且Tim‐3 在多种免疫细胞上都有表达，共同发挥着免疫抑制作用。较多的相关研究集中在效应细胞NK 细胞和T 细胞上。外周血NK（pNK）细胞上Tim‐3 的表达在妊娠前三个月大量增加，Tim‐3+pNK 细胞具有强的免疫抑制能力，产生更多的抗炎细胞因子，如TGF‐β1，IL‐10 和IL‐4，并且对滋养细胞的细胞毒性降低，有利于免疫耐受微环境的形成，该过程可能是由IL‐4–STAT6 或孕激素信号通路介导的［40］。外周血淋巴细胞上Tim‐3 的表达和血清中Th1 来源的细胞因子水平呈负相关，Tim‐3 通过抑制促炎性细胞因子的释放减弱Th1 相关的免疫效应，并影响妊娠期间外周免疫系统免疫应答的平衡［41］。在母胎界面，TIM‐3 通路被阻断后，小鼠uNK 细胞产生的促血管生成相关的细胞因子IFN‐γ 和VEGF 以及免疫抑制细胞因子IL‐10 均减少，提示血管重塑的过程被抑制，胚胎着床受阻［42］。在Tregs 细胞中，Tim‐3 的表达在妊娠中期达到峰值，Tim‐3+Tregs 细胞的活性以及对Teffs 细胞增殖的抑制作用明显优于Tim‐3‐Tregs 细胞。除了效应细胞，Tim‐3 在骨髓源性细胞上也有所表达。Tim‐3 阻断导致小鼠子宫巨噬细胞吞噬特性降低，不能从子宫中清除凋亡和死亡细胞，引起两个骨髓细胞亚群M‐MDSC 和CD11b+Ly6CintGhi 的活化，然而抑制性M‐MDSC 未能抵消炎性CD11b Ly6CintGhi 粒细胞作用的结果，导致母胎界面局部炎症增强和胎仔丢失率增加［43］。

与未怀孕的女性相比，Tim‐3 在孕妇外周血中的单核细胞和NK 细胞上的表达显著上调。单核细胞上Tim‐3 的表达可能受Th2 细胞因子IL‐4 的调控，Tim‐3+单核细胞调节组织清除凋亡细胞，并且通过抗原加工过程促进胎儿耐受性［44］。由于Tim‐3与其配体Gal‐9 相互作用的结果，Tim‐3+NK 细胞的细胞毒性显着低于Tim‐3‐NK 细胞，并且具有高分泌Th2 型细胞因子的能力。此外，人滋养层细胞可通 过 分 泌Gal‐9 与Tim‐3 相 结 合，诱 导pNK 细 胞 向dNK 样表型转化，用抗Tim‐3 中和抗体阻断Tim‐3信号通路可消除滋养细胞诱导的NK 细胞分化。dNK 细胞是MFI 下的主要Tim‐3 阳性细胞类型，dNK 细胞上Tim‐3 的表达水平明显高于pNK 细胞［45］。促炎细胞因子的强效诱导剂脂多糖与其配体Toll 样受体4 结合后，引起dNK 细胞产生的TNF‐α 显著增加，启动强烈的炎症反应，Tim‐3 能够通过激活ERK1/2 通路，抑制NF‐κB 的活化和上调干扰素调节因子4 的表达来逆转LPS 对Th2 细胞因子生成的抑制作用［46］。此外，滋养细胞产生的IL‐27 和Gal‐9 协同促进CD4+T 细胞中Tim‐3 的表达和Tim‐3 信号通路的激活，从而促进了Tim‐3+Treg 细 胞 的 蓄 积 以 及Tregs/Teffs 细 胞 的平衡［47］。

3.2 Tim‐3 与妊娠并发症

在URSA 患者中，pNK 细胞表达的Tim‐3 水平低于正常妊娠组，并且来自URSA 患者的Tim‐3+pNK 细胞免疫抑制活性降低，细胞毒性增强，表明URSA 患者Tim‐3+pNK 细胞存在功能缺陷［40］。URSA 患者血清中sTim‐3 含量比正常妊娠妇女增加，而sGal‐9 含量减少，推测可能增加的sTim‐3 阻 断 了Tim‐3 与Galectin‐9 的 结 合，抑 制 了Tim‐3/Galectin‐9 的表达［48］。在母胎界面，免疫组织化学研究显示URSA 妇女的蜕膜组织减少了Tim‐3 的表达，通过流式细胞术在蜕膜基质细胞中也证实了相同的发现。此外，Tim‐3 基因的唯一遗传多态性分析是在URSA 患者中进行的。Tim‐3的多态性会影响配体结合特性，并可能引起某些免疫介导的疾病。然而，分析Tim‐3 基因启动子区的多态性，在健康的孕妇和URSA 患者中没有观察到不同基因型频率之间的差异，但目前相关的报道较少，因此需要更多的研究来印证此结论［49］。

在子痫患者外周血中，T 细胞、细胞毒性 T 细胞、NK 细 胞 和 CD56dimNK 细 胞 的 Tim‐3 表 达 降低，而 蜕 膜 组 织 中 的Tim‐3 和Gal‐9 的 表 达 均 被 上调［50，51］。蜕 膜Tim‐3 和Gal‐9 的 过 度 表 达 可 能 破 坏了Tim‐3/Gal‐9 通路的平衡，导致Th1 和Th17 细胞无法有效负向调节，导致Th1 和Th17 细胞分泌增加，进而引发先兆子痫的发生［51］。

4 结论

免疫检查点分子在胚胎植入、母胎耐受诱导和妊娠进程中发挥重要作用，有望成为临床干预妊娠并发症的靶标。尽管目前关于免疫检查点分子参与生殖免疫的机制研究较为深入，但仍有很多难题尚未解开，近期新出现的几种免疫检查分子如淋巴细胞激活基因 3、T 细胞免疫受体和 T 细胞激活的V 域 Ig 抑制因子等成为了接下来的研究热点。此外，针对 PD‐1/PD‐L1 和 CTLA‐4 通路的免疫检查点抑制剂是晚期恶性肿瘤的革命性疗法，然而免疫检查点分子的阻断会对妊娠结局带来不利影响，因此对于临床上应用检查点抑制剂的患者的生殖评估就显得尤为重要。

作者贡献度说明：

王艺绚：论文撰写、数据整理、统计分析、论文修改；连方：研究指导、经费支持；庞聪慧：研究指导、论文修改；于晓娜、官璐：数据整理。

所有作者声明不存在利益冲突关系。