基于网络药理学研究扶正化瘀降浊通络方治疗慢性肾衰竭的作用机制*

何剑川,付饶,邹小康,陈明

1.四川省中西医结合医院,四川 成都 610041; 2.成都中医药大学附属医院,四川 成都 610072

慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)是慢性肾病持续发展的最终结局,主要表现为内环境失衡、代谢产物潴留及各系统症状,是各种原因导致肾功能进行性减退、代谢紊乱和临床症状组成的综合征[1]。CRF发病机制复杂,西医治疗手段有限,对患者的生命与生活质量产生严重影响。祖国医学并无“慢性肾衰竭”这一病名记载,现代医家根据证候特点及临床表现,将其归属于“关格”“水肿” “肾劳”等范畴,认为“本虚标实,虚实夹杂”是其基本病机[2],“补脾益肾、通腑泄浊”是其治疗大法。叶传蕙教授基于此理论研发的具有扶正化瘀降浊功效的“肾康”广泛应用于临床,已成为治疗CRF的重要药物[3]。陈明教授在“肾康”的基础上,结合防治肝脏纤维化中使用“大黄虫丸”的经验,化裁出“通补并用、标本兼施”的“扶正化瘀降浊通络方”,该方以大黄、黄芪、熟地黄为君药,丹参、红花、酒水蛭、土鳖虫为臣药,黄芩为佐药,甘草为使药,诸药合用,达到健脾益肾、理气固本、通腑泄浊的目的。扶正化瘀降浊通络方治疗CRF疗效确切,但尚未阐明其药理学机制,值得深入研究。

在多学科理论的基础上,网络药理学从不同角度分析药物治疗疾病的机制。该方法与中药多成分、多靶点、多途径的作用特点相契合[4],在中药领域的研究中得到广泛应用。本研究拟采取该方法探索扶正化瘀降浊通络方治疗CRF的药效成分、药物靶点、信号通路等信息,为今后基础研究提供大致方向。

1 资料与方法

1.1 筛选主要活性成分经中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[5-6]收集大黄、黄芪、熟地黄、丹参、红花、黄芩、甘草的化学成分,设置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(drug-likeness,DL)≥0.18对化学成分进行筛选;通过TCMID数据库收集水蛭化学成分,利用BATMAN-TCM数据库[7]“药物-靶点”相似性模型,设置分数截止点≥20,调整后P值≤0.05,筛选水蛭活性成分;通过检索中国知网、维普网、万方数据、PubMed、Web of Science等国内外文献数据库,查阅土鳖虫活性成分相关文献,收集土鳖虫活性成分。结合PubChem、SwissADME数据库对活性成分分子结构进行验证,将结果保存为mol2格式文件。

1.2 预测潜在靶点登录PharmMapper数据库[8],上传活性成分相关结果,下载药物靶点名称、蛋白库编码、拟合分数等信息。拟合分数用于评价活性成分与靶点的匹配度,分值越高,二者越匹配。为提高预测精度,靶点纳入标准设为拟合分数≥3。将纳入靶点的蛋白库编码整合到UniProt数据库中,将其矫正为人类相关蛋白编码。在GeneCards数据库、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM)[9-10]输入关键词“Chronic Renal Failure”检索CRF相关靶点,去重后构建CRF靶点库。将扶正化瘀降浊通络方作用靶点与CRF靶点数据上传Venny2.1.0进行映射,交集靶点即为扶正化瘀降浊通络方治疗CRF的潜在靶点,并绘制靶点韦恩图。

1.3 关键靶点相互作用网络将潜在靶点导入STRING数据库,进行蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)分析,筛选自由度高于均值的靶点建立子网络,选取子网络中的关键靶点构建PPI网络。将PPI网络的节点1、节点2和综合评分信息导入Gephi软件[11],进行网络分析和可视化分析。

1.4 “药物-成分-靶点”网络将关键靶点、药物活性成分及其对应靶点的信息导入Cytoscape3.7.2软件,建立“药物-成分-靶点”网络,选取各药物核心靶点度值排名前3位的活性成分作为核心成分。

1.5 富集分析将关键靶点导入DAVID数据库,进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析。

1.6 “信号通路-靶点”网络构建将CRF相关通路与相应靶点信息导入Cytoscape 3.7.2软件构建并分析“信号通路-靶点”网络。

1.7 “药物-核心成分-核心靶点-信号通路”网络整合研究所得有效信息,将药物、核心化学成分、核心靶点及信号通路导入Cytoscape 3.7.2软件构建并分析扶正化瘀降浊通络方治疗CRF的“药物-核心成分-核心靶点-信号通路”网络。

2 结果

2.1 药物活性成分通过TCMSP数据库收集到大黄92个、黄芪87个、熟地黄76个、丹参202个、红花189个、黄芩143个、甘草280个化学成分,利用OB≥30%、DL≥0.18筛选得到大黄16个、黄芪20个、熟地黄2个、丹参65个、红花22个、黄芩36个、甘草92个主要活性成分;通过 TCMID 数据库检索得到水蛭活性成分35个,利用BATMAN-TCM分析工具筛选得到主要活性成分15个,其中2个活性成分未找到相对应的作用靶点,通过分子结构验证,最终筛选得到主要活性成分13个;通过对已报道的土鳖虫活性成分进行系统整理,搜集得到活性成分76个,通过分子结构验证,筛选得到主要活性成分50个。君药大黄、黄芪、熟地黄的结果见表1。

表1 大黄、黄芪、熟地黄主要活性成分

2.2 潜在靶点合并重复项,剔除假阳性项后得到大黄1 360个、黄芪918个、熟地黄222个、丹参 1 404 个、红花783个、黄芩916个、甘草1 589个、水蛭343个、土鳖虫757个作用靶点,整合得到扶正化瘀降浊通络方作用靶点2 263个。通过Genecards、OMIM构建CRF靶点库,共涉及7 806个靶点。将二者进行映射,筛选出潜在靶点635个,见图1。

图1 潜在靶点VEEN图

2.3 关键靶点PPI网络潜在靶点PPI网络包含635个节点,3 414条边,节点自由度均值为10.9。子网络包含242个节点,2 300条边,节点自由度均值为19。子网络中靶点自由度大于均值的关键靶点共130个。关键靶点PPI网络包括130个节点,1 320 条边,平均节点自由度为20.3,靶点自由度为均值3倍以上的核心靶点共20个,见表2、图2。

表2 核心靶点汇总表

图2 关键靶点PPI网络

2.4 “药物-成分-靶点”网络将关键靶点、药物活性成分及其对应靶点的信息导入Cytoscape 3.7.2软件,建立“药物-成分-靶点”网络。各药物与关键靶点存在相互作用的活性成分分别为大黄16个,黄芪20个,熟地黄2个,丹参57个,红花20个,黄芩34个,甘草91个,水蛭7个,土鳖虫41个,结果见图3。各君药度值排名前3位的活性成分见表3。

表3 君药治疗慢性肾衰竭的核心成分汇总表

图3 “药物-成分-靶点”网络

2.5 GO富集分析GO富集分析共涉及662项生物功能,其中506项与关键靶点显著相关(P<0.05),显著相关项中包含分子功能98项,细胞成分50项,生物过程358项。按P值从低到高排序,取各类别中排名前10位的生物功能进行分析,见图4。

图4 GO富集分析

2.6 KEGG通路分析共涉及105条信号通路,与关键靶点显著相关(P<0.05)的通路共96条。筛选出与CRF相关的20条关键信号通路进行分析,见图5。

图5 KEGG通路分析

2.7 “信号通路-靶点”网络将相关通路与相应靶点信息导入Cytoscape3.7.2软件,构建“信号通路-靶点”网络,选取度值排名前10位的靶点进行分析,见表4、图6。

表4 “信号通路-靶点”网络排名前10位的靶点

图6 “信号通路-靶点”网络

2.8 “药物-核心成分-核心靶点-信号通路”网络将研究结果导入Cytoscape3.7.2软件,建立“药物-核心成分-核心靶点-信号通路”网络,见图7。

图7 “药物-核心成分-核心靶点-信号通路”网络

3 讨论

君药是方中不可或缺且药力居首,针对主病或主证起主要治疗作用的药物,扶正化瘀降浊通络方以大黄、黄芪、熟地黄为君,大黄性寒、味苦,有凉血解毒、泻下攻积、逐瘀通经等功效。大黄素甲醚二葡糖苷等蒽醌类成分可能是大黄的核心药效成分。CRF发病机制复杂,正虚是发病的基础,血瘀是主要病理改变,浊毒是疾病进展的首因[12]。针对血瘀这一病理改变,大黄可通过改变机体血流动力学特征、改善局部微循环、预防血栓形成等药理作用发挥逐瘀通经的功效。现代药理学研究表明,大黄可通过调节机体血管内渗透压的变化,使细胞外液重新分布,从而改善肾脏微循环、改变机体血流动力学特征[13]。西医代谢产物潴留的概念与中医的浊毒极其相似,浊毒既是机体内积聚的病理产物,也是疾病发生发展的致病因素。大黄具有通利水谷、涤荡胃肠的功效,可给邪出路,使浊毒从二便解,避免闭门留寇。大黄蒽醌类活性成分能有效抑制结肠水通道蛋白的表达,降低Na+-K+-ATP酶活性,从而增加肠道内水含量,避免大便过于干燥;还对肠壁黏膜和肌内神经丛有刺激作用,增加结肠的蠕动次数,发挥泻下作用[14-15]。此外,大黄素亦能增加输尿管平滑肌的活性,降低肾髓质基底膜侧Na+-K+-ATP酶活性,起到通利小便的作用。因而可知,大黄蒽醌类活性成分可通过泻下攻积、逐瘀通经等功效,对血瘀、浊毒等致病因素发挥治疗作用。黄芪味甘、性温,有补气固表、利尿托毒等功效。本研究筛选得到20个黄芪主要成分,以黄酮类、多糖类、皂苷类成分为主。黄芪总黄酮在体内和体外均有免疫调节功能,能调控丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、核转录因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)在巨噬细胞中的表达,抑制IL-6、肿瘤坏死因子等炎症因子的分泌,起到抗炎作用[16],还能抑制转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)表达、减轻炎症反应、抑制大量NO生成,从而减少肾脏系膜细胞增殖、防止ECM过度生成、减轻肾脏结构损伤,延缓肾功能进展[17-18]。本研究筛选得到豆甾醇、谷甾醇2个熟地黄主要成分,二者均与多个关键靶点存在对应关系。此外,丹参、红花、酒水蛭、土鳖虫等药物中也有多个活性成分与多个关键靶点之间存在对应关系,表明扶正化瘀降浊通络方治疗CRF具有“多成分”“多靶点”的特点。

扶正化瘀降浊通络方治疗CRF可能与凋亡过程的负调控、基因表达的正调控、细胞增殖的正调控等生物学过程有关,涉及胞外体、细胞外间隙、溶酶体等细胞成分,蛋白质结合、酶结合、受体结合等分子功能也参与其中。岳艳利等[19]使用不同浓度的黄芪总苷治疗糖尿病小鼠发现,黄芪总苷能通过下调糖尿病小鼠肾脏TGF-β1的表达,进而抑制 COL-Ⅳ等ECM主要组成部分的积聚,有效阻止肾功能损害的进程。王杰[20]通过动物实验研究发现,扶正化瘀降浊通络方可抑制5/6肾切除大鼠肾组织TIMP-1的表达、促进MMP9的表达,使GBM堆积减少、COL-IV降解增加,发挥肾脏保护作用。提示扶正化瘀降浊通络方可能通过减少细胞凋亡、抑制ECM合成等机制延缓CRF的进展。

整合PPI网络与“相关通路-相应靶点”网络中重要靶点的信息发现,靶点PIK3CA、AKT1、MAPK3、EGFR、VEGFA存在重叠,可能是该方治疗CRF的首要靶点。KEGG通路分析结果表明:首要靶点主要涉及PI3K/Akt、HIF-1、VEGF、TGF-β、NF-κB、Toll-like、白细胞跨内膜迁移、B细胞受体、T细胞受体等通路。其中,PI3K/Akt、HIF-1、VEGF、TGF-β等信号通路与调节肾脏纤维化进程紧密相关。在梗阻型肾病大鼠的肾小管间质中Akt、磷酸化Akt表达水平显著上升[21],大黄可下调PI3K/Akt的表达,减少大鼠肾间质中成纤维细胞的增生、炎症细胞的侵蚀,减慢纤维化速度[22-23]。在CRF发展过程中,HIF-1、VEGF等通路扮演着重要角色,组织缺氧可激活HIF-1、VEGF等信号通路,从而平衡纤维化调节因子的表达,起到调控组织纤维化进程的作用[24]。陈艳琼[25]通过扶正化瘀降浊通络方治疗5/6肾切除大鼠研究发现:与假手术组相比,模型组大鼠肾脏组织VEGF的表达显著降低,且与时间成反比,治疗组大鼠VEGF显著增高。提示该方能上调CRF大鼠VEGF的表达,减少肾脏纤维化,延缓病程进展。TGF-β可促进肾小管上皮细胞转分化、炎症细胞募集与激活、ECM合成与沉积,导致肾脏纤维化[26]。何凯杰[27]通过5/6肾切除大鼠研究发现,扶正化瘀降浊通络方可调节 TGF-β信号通路关键因子——降低Smurf 2表达水平、促进Smad7表达水平改善5/6肾切除大鼠肾纤维化程度。

近年来,大量研究揭示了CRF中肠道与肾脏之间的双向作用关系,即“肠-肾轴”理论[28],为CRF的治疗提供了新方向。肠道屏障受损是CRF“肠-肾轴”的核心环节。肠道免疫屏障中的Toll样受体/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信号通路既是肠道免疫屏障的组成部分,也是连接机械屏障及生物屏障的桥梁,该通路的激活可使肠道炎症级联放大[29]。Ren ZG等[30]研究证实CRF患者肠道菌群多样性降低,硫酸吲哚酚、脂多糖、硫酸对甲酚等毒素增加,高水平的硫酸吲哚酚可激活肠上皮细胞TLRs/NF-κB通路,促进炎性细胞因子的生成并进入循环导致全身炎症和CRF的进展,提示肠道黏膜免疫活化是诱导全身性微炎症反应和CRF进展的重要病理机制,调控TLRs/NF-κB信号通路的表达是纠正肠道黏膜免疫偏移、促进肠道屏障功能修复、延缓CRF进展的关键。本研究发现,扶正化瘀降浊通络方除了与PI3K/Akt、HIF-1、VEGF、TGF-β等肾脏纤维化经典通路密切相关外,还涉及NF-κB、Toll-like、B细胞受体、T细胞受体等炎症和免疫相关的通路。这既是对扶正化瘀降浊通络方治疗CRF相关研究结果的一个佐证,也为该方更明确的机制研究提供了参考依据。结合“肠-肾轴”理论及相关领域的研究进展,扶正化瘀降浊通络方能否通过重塑肠道菌群稳态,平衡肠肾免疫微环境而调控“肠-肾轴”以延缓CRF进展呢?结合本研究结果推测,扶正化瘀降浊通络方可能通过平衡肠道菌群失调,调节TLRs/NF-κB信号通路的表达,从而减轻肠道及全身炎症反应,调控机体免疫功能,发挥肾脏保护作用,但该假说有待进一步多学科研究的验证。