多房棘球绦虫基因组DNA三种提取方法的比较

王明坤, 孜比姑·肉素, 李德伟, 余 倩, 李 静, 张传山,2, 王 慧,2

(1新疆医科大学基础医学院, 乌鲁木齐 830017; 2新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院, 乌鲁木齐 830054)

包虫病(棘球蚴病),是一种严重危害人民身体健康和阻碍社会经济发展的人兽共患寄生虫病,已成为全球性的公共卫生问题[1]。其中,由多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis,E.m)幼虫感染引起的泡型棘球蚴病(Alveolar echinococcosis,AE)呈恶性侵袭性生长,病灶类似缓慢生长的肝癌,俗称“虫癌”,病死率高[2-4]。研究表明,不同地域来源的E.m虫株对宿主的致病能力和器官的损伤程度不同[5-6]。然而,棘球绦虫虫株变异范围广,从虫株本身的基因型差异对虫株进行明确分型并分析不同虫株间的遗传变异差异,从而找到不同虫株致病的“关键毒力因子”,将对研制疫苗、诊断抗原和治疗药物有重大意义。目前,通过有效提取不同地域来源的E.m虫株样本中的基因组DNA,进行核基因延伸蛋白样蛋白(Ezrin/radixin/moesin-like protein,elp)、线粒体相关基因细胞色素b(Cytochrome b,cob)、NADH 脱氢酶亚基2(NADH dehydrogenase subunit 2,nad2)和细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit 1,cox1)片段的有效扩增和测序分析,定义了18个E.m单倍体基因型[7]。因此,提取高质量的E.m虫体样本基因组DNA对后续高效扩增elp、cob、nad2和cox1基因进行准确虫株分型至关重要。本研究通过使用95℃水浴法、碱裂解法及离心柱法提取E.m原头节(Protoscoleces,PSCs)和囊壁组织样本中的基因组DNA,并进行浓度、A260/A280比值及elp、cob、nad2和cox1基因扩增效果的综合比较,以期筛选出适宜高效扩增E.m线粒体相关基因的基因组DNA提取方法,使得虫株基因型鉴定更加准确和稳定,为进一步开展E.m分子遗传学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器、设备与试剂Nano Drop-1000微量核酸浓度测定仪(Thermo 公司,美国),DYY-6D电泳仪(北京六一生物科技有限公司),高速冷冻离心机(Eppendorf 公司,德国),DK-88恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司),Thermal Cycler PCR扩增仪以及GelDoc XR+凝胶成像系统(Bio-Rad公司,美国),组织基因组DNA提取试剂盒(江苏康为世纪生物科技股份有限公司,货号:CW2298M),核酸染料(百泰克生物技术有限公司),2×Taq Master Mix(Biomiga公司,美国)、DL2000 Marker和5×TBE(上海生工生物工程股份有限公司),蛋白酶K(江苏康为世纪生物科技股份有限公司),氢氧化钠和三羟甲基氨基甲烷均为国产分析纯试剂,引物由上海生工合成。

1.2 实验动物、多房棘球绦虫组织样本收集使用3只SPF级保种小鼠,饲养于新疆医科大学实验动物中心,无菌条件下取小鼠脚趾和鼠尾组织置于1.5 mL离心管中冻存备用。参照文献[8],无菌条件下分离多房棘球蚴保种鼠腹腔中的病灶组织,置于100 目的钢网上剪碎并进行研磨过滤,收集的原头节用生理盐水洗涤3～5次,取15 μL虫体沉淀于1.5 mL离心管中冻存备用;取部分囊壁组织研磨后置于1.5 mL离心管中冻存备用。

1.3 基因组DNA提取分别采用95 ℃水浴法、碱裂解法及离心柱法等3种方法提取多房棘球绦虫原头节、囊壁虫体组织样本基因组DNA;采用离心柱法提取小鼠组织样本基因组DNA。

1.3.1 95℃水浴法提取 参照文献[9],取15 μL虫体沉淀,加入30 μL蛋白酶K,涡旋震荡混匀,56℃水浴锅过夜;次日取出样本短暂离心后放入95℃水浴锅10 min; 从水浴锅中取出,冷却2 min后, 12 000 r/min离心5 min,上清为基因组DNA,-20℃保存备用。

1.3.2 碱裂解法提取 取15 μL虫体沉淀,加入100 μL,50 mmol/L的氢氧化钠(NAOH)溶液混匀,于干式恒温加热器中95℃加热30 min,加入8.3 μL,1 mmol/L 的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCL)混匀,6 000 r/min离心5 min,上清为基因组DNA,-20℃保存备用。

1.3.3 离心柱法提取 分别取15 μL虫体沉淀和研磨后的囊壁组织,严格按照组织基因组DNA离心柱法提取试剂盒说明书进行DNA提取,洗脱收集的基因组DNA,-20℃保存备用。

1.4 基因组DNAA260/A280 比值和浓度的测定分别取2 μL上述3种方法提取的基因组DNA样本,使用 Nano Drop-1000微量核酸浓度测定仪测定基因组DNA浓度和A260/A280比值,琼脂糖凝胶电泳检测比较3种方法提取的基因组DNA的质量。

1.5 多房棘球绦虫线粒体相关基因的PCR扩增参考文献[7,10]合成扩增E.m线粒体基因(cob,nad2和cox1)及核基因elp片段的引物(表1)。PCR反应体系(20 μL):2×Taq PCR Master Mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,基因组DNA模板2 μL(250 ng),焦碳酸二乙脂(DEPC)水补足至20 μL;PCR反应条件:94℃,90 s;94℃,30 s;62℃,30 s;72℃,1～3 min,其中elp(1 min),cob、nad2(2 min 30 s),cox1(3 min),11个循环,每个循环退火温度下降1℃;94℃,30 s;55℃,30 s;72℃,1～3 min,其中elp(1 min),cob、nad2(2 min 30 s),cox1(3 min),24个循环;72℃延伸5 min。并以提取的小鼠组织基因组DNA作为对照,取5 μL PCR扩增的产物进行1.5 %的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 不同方法提取PSCs基因组DNA浓度、A260/A280比值和线粒体基因扩增效果比较3种方法提取的PSCs基因组DNA浓度分别为,95℃水浴法(1 090.14±118.51)ng/μL、碱裂解法(201.48±6.11)ng/μL和离心柱法(87.17±8.97)ng/μL;A260/A280比值分别为(1.14±0.02)、(1.41±0.01)和(1.85±0.28),离心柱法提取的DNAA260/A280比值显著高于95℃水浴法和碱裂解法(F=15.10,P<0.01)。琼脂糖凝胶电泳结果显示,离心柱法提取的PSCs基因组DNA无降解、无RNA或蛋白质等成分污染,而95℃水浴法和碱裂解法提取的DNAA260/A280比值低,存在残留蛋白质等成分污染导致电泳迁移较慢(图1)。以3种方法提取的PSCs基因组DNA为模板,扩增elp、cob、nad2和cox1基因片段结果显示,在加样模板总量一致的情况下,3种方法提取的DNA均可扩增出核基因elp(68 bp)的目的条带,且以离心柱法提取的DNA为模板扩增的条带最亮;95℃水浴法和碱裂解法提取的DNA只有效扩增出线粒体cob(1 068 bp)基因,nad2(882 bp)和cox1(1 608 bp)基因扩增效果不佳,而离心柱法提取的DNA可同时有效扩增出三个线粒体基因,且电泳条带清晰、明亮,片段长度准确(图2)。

A,基因组DNA吸光值曲线;B,基因组DNA浓度;C,基因组DNA A260/A280比值;D,3种方法提取PSCs基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳(Lane M,DNA 8 000 marker;Lane1,95℃水浴法;Lane2,碱裂解法;Lane3,离心柱法); *P< 0.05; **P<0.01; ***P<0.001。

注:Lane M, DNA 2 000 marker; Lane 1～3,95℃水浴法提取的基因组DNA模板;Lane 4～6,碱裂解法提取的基因组DNA模板;Lane 7～9,离心柱法提取的基因组DNA模板。

2.2 虫体不同组织样本中基因组DNA的浓度、A260/A280比值和线粒体基因扩增效果比较基于上述结果,选取能够有效提取并扩增线粒体相关基因的离心柱法来提取PSCs和囊壁组织中的基因组DNA。结果显示,从囊壁组织中提取的DNA浓度(190.03±136.19)ng/μL高于从PSCs中提取的DNA浓度(40.95±19.45)ng/μL,但差异无统计学意义(t=1.46,P>0.05);囊壁组织基因组DNAA260/A280比值(1.42±0.38)低于PSCs基因组DNAA260/A280比值(1.69±0.03),差异无统计学意义(t=0.95,P>0.05)(图3)。分别以提取的PSCs和囊壁组织基因组DNA为模板,扩增elp、cob、nad2和cox1基因片段结果显示,PSCs基因组DNA可扩增出全部目的基因片段,而囊壁组织基因组DNA仅扩增出elp基因,线粒体基因cob、nad2和cox1均未得到有效扩增(图4)。为排除宿主来源的细胞对结果可能的影响,进一步提取宿主(小鼠)组织的基因组DNA,并以其为模板同时扩增虫体elp、cob、nad2和cox1基因片段结果显示,以PSCs基因组DNA为模板可扩增出虫体全部目的基因片段,而以小鼠组织基因组DNA为模板未扩增出任何虫体的目的基因片段(图5)。

注:A,基因组DNA吸光值曲线;B,基因组DNA浓度;C,基因组DNA A260/A280比值。

注:Lane M,DNA 2 000 marker; Lane1～2,PSCs的基因组DNA模板;Lane 3～4,为囊壁的基因组DNA模板;Lane 5,为阴性对照。

3 讨论

流行病学调查和基础研究资料表明,不同地域来源的多房棘球绦虫虫株在遗传特性、致病力和宿主选择上有较大差异[5,7]。线粒体基因的遗传差异是导致寄生虫致病差异的主要原因,也是不同虫株分型的主要标志[11-12]。目前,主要通过采用PCR扩增获得虫体线粒体DNA基因序列(如:cob、nad2和cox1),比对分析基因序列的差异,进而对各虫株进行分型[7, 13-15]。寄生虫基因组DNA提取的质量与线粒体基因的有效扩增密切相关。因此,筛选适宜的基因组DNA提取方法对后续虫株的准确分型尤为重要。

本研究使用95℃水浴法、碱裂解法及离心柱法分别从分离的PSCs样本中提取基因组DNA,从提取的基因组DNA浓度、A260/A280比值和扩增多房棘球绦虫核基因elp及线粒体基因cob,nad2和cox1的效果进行综合比较,发现3种方法提取的基因组DNA质量存在明显差异。其中,95℃水浴法提取的DNA浓度最高,A260/A280比值最低;离心柱提取的DNA浓度最低,A260/A280比值最高;碱裂解法提取的DNA的浓度和A260/A280比值介于二者之间。3种方法均能扩增出elp基因,表明均能够从PSCs中提取出虫体基因组DNA,但只有离心柱法提取的DNA能够全部有效扩增出虫体的3个线粒体基因。95℃水浴法和碱裂解法提取的DNA仅能有效扩增出cob基因。其原因可能是95℃水浴法是先在样本中加入蛋白酶K,可酶解与核酸结合的组蛋白,提高了对虫体的裂解效率,因此获得的DNA浓度高,但此法未经抽提除去杂质,故A260/A280比值低。同时由于核酸酶的存在及高温环境下,DNA易降解,线粒体基因的扩增效率较低。碱裂解法是通过氢氧化钠的裂解作用提取样本基因组DNA,该方法用时短,但得到的DNAA260/A280比值与扩增效率均较低。离心柱法是在样本中加入蛋白酶K酶解后,通过吸附柱的吸附、漂洗和洗脱等步骤,有效去除了杂质,得到的基因组DNAA260/A280比值较高,且能高效扩增出3个线粒体相关基因。说明通过离心柱法提取的PSCs基因组DNA更适于不同虫株的分型鉴定。临床AE患者手术样本中几乎无法获得PSCs,但可获得足量的囊壁病灶组织样本。因此,本研究采用离心柱法来提取同一株系来源的PSCs和囊壁组织中的基因组DNA为模板进行扩增比较,发现该法提取的囊壁组织基因组DNAA260/A280比值偏低,仅扩增出elp基因,线粒体基因cob、nad2和cox1均未得到有效扩增,其原因可能与囊壁特有的组织结构有关。囊壁多由纤维增生、生发层及大量宿主来源的炎性细胞构成,生发层仅里有部分未成熟的PSCs[16-18],故使用囊壁组织提取基因组DNA扩增效率较低。同时,为排除宿主因素的干扰,本研究使用离心柱法提取了宿主(小鼠)组织的基因组DNA作为对照发现,未扩增出虫体elp和线粒体基因cob、nad2和cox1,表明离心柱法提取的虫体样本基因组DNA扩增敏感度高、特异性强,无宿主来源细胞的污染。

综上,本研究从提取的虫体不同样本中的基因组DNAA260/A280比值、浓度及线粒体相关基因扩增效果等方面综合比较,得出采用离心柱法从多房棘球绦虫的PSCs中提取的基因组DNAA260/A280比值和目的基因扩增效果最佳,更适宜于实验室对多房棘球绦虫不同虫株基因型的有效鉴定研究。