外周血IL-27、IL-35与巨噬细胞极化相关mRNA在活动性肺结核中的表达水平及预测价值研究

马雨婕, 王 晶, 李 颖, 加孜那·托哈依

(1新疆医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科, 乌鲁木齐 830054; 2海南医科大学第二附属医院呼吸内科, 海口 570100;3省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室, 乌鲁木齐 830054)

全球结核病负担仍然沉重,对活动性肺结核的快速诊断和预防不容忽视[1]。巨噬细胞是抗结核感染最主要的细胞之一,其两种(M1/M2型)极化状态可通过调节促炎或抗炎信号的表达来控制病理,导致感染的不同结局[2]。结核中巨噬细胞M1极化伴随高水平的γ-干扰素(IFN-γ)、C-X-C基序配体(CXCL10与CXCL11)等分泌,M2极化伴随高水平的白介素10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)等分泌[3-4]。研究表明外周血血浆中IFN-γ、IL-10、趋化因子CXCL10、CXCL11对诊断活动性肺结核具有价值[5-6],血浆TGF-β的变化与肺结核的肺损伤有关[7]。IL-12家族因子在结核中参与巨噬细胞等多种细胞的免疫调节。研究表明IL-12家族成员IL-27与IL-35在肺结核外周血血浆中的表达升高,被认为是判断结核的可能标志物;IL-27、IL-35亚单位即P35亚基、EB病毒诱导基因3编码蛋白(EBI3)的mRNA在活动性肺结核患者外周血单核细胞中表达增高,且与疾病严重程度有关[8-9]。本文探究上述因子(IL-27、EBI3、P35、IFN-γ、CXCL10、CXCL11、IL-10和TGF-β)在活动性肺结核患者外周血的mRNA表达并评估其预测价值,以探讨其在结核免疫中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象以新疆医科大学第一附属医院2020年3月-2021年12月入院且诊断为活动性肺结核的46例患者为病例组,选取同期于本院体检的42例健康非肺结核人员为对照组。本研究已通过新疆医科大学伦理委员会批准(伦理批准号: 20200320-142) ,取得纳入对象知情同意。

1.2 纳入标准病例组按照2018年发布的《WS288-2017结核病诊断》诊断为结核病[10],根据病原学和影像学检查结果诊断为活动性肺结核。诊断依据(存在以下情况一项及以上):(1)痰涂片或痰培养检查中结核分枝杆菌阳性;(2)影像学中有结核活动性的肺部征象;(3)痰结核菌检查阳性后未治疗或治疗未达规定疗程,仍有症状或检查结果未改善。对照组为健康非结核的体检人员且不符合结核病的诊断标准[10]。以上诊断由2位经验医师根据上述标准综合分析后各自做出。研究对象都同意保留血液样本并进行相关检查。

1.3 排除标准(1)伴有肿瘤、免疫性疾病(如败血症、菌血症、病毒性肝炎、HIV感染等结核外感染、类风湿等),服用化疗药、激素或免疫抑制剂人员;(2)严重心、肝、肾功能不全或精神系统疾病患者;(3)处于妊娠或哺乳期;(4)无法获得血样和临床资料的人员。

1.4 检测方法分别收集两组入选者的临床资料,并收集清晨空腹时的外周静脉血5 mL,全血离心(3 000 r/min,5 min) 后收集血清外剩余液体,加入红细胞裂解液1 mL冰上置10 min。离心(3 000 r/min,5 min) 弃上清后用PBS 1 mL清洗1～2次,保留裂解后沉淀物。用Trizol试剂盒(北京全式金公司)提取细胞总RNA沉淀,用20～40 μL DEPC去离子水(北京酷来博科技有限公司)重悬在EP管中,在-80℃ 冰箱中保存以备后用。使用逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司No.RR037A)逆转录具有合格纯度和浓度的RNA为cDNA:将RNA调至500 ng/μL,根据说明制备10 μL逆转录体系。逆转录反应在37℃中15 min,后在85℃进行5 s使逆转录酶失活,反应在4℃下直至结束,cDNA可放在-20℃冰箱中保存。用实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司No.RR820A)制备相应体系(含有1 μL cDNA,5 μL TB Green溶液,0.2 μL ROX染料,0.4 μL正向、反向引物和3 μL DEPC水以补足为10 μL体系)。将测定指标的正向和反向引物(引物合成于上海生工生物工程公司,序列见表1)按比例加入体系,设置Q6荧光定量PCR仪为95℃预变性34 s,95℃反应5 s,后于60℃退火30 s,并循环进行40次PCR反应;收集熔解曲线和拷贝数(CT) 值,并采用2-ΔΔCT法计算相对mRNA表达。

2 结果

2.1 病例组与对照组临床资料比较病例组与对照组性别、年龄及体质指数差异无统计学意义(P>0.05)。病例组白细胞计数、C反应蛋白水平高于对照组,血红蛋白、白蛋白水平低于对照组,差异有统计学意义(P均<0.05),见表2。

表2 病例组与对照组临床资料比较

2.2 病例组与对照组外周血IL-27、EBI3、P35及巨噬细胞相关mRNA表达水平的比较病例组外周血中IL-27、EBI3、IFN-γ、CXCL10、CXCL11、IL-10和TGF-β的mRNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);病例组和对照组P35的mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 病例组与对照组外周血IL-27、EBI3、P35及巨噬细胞相关mRNA表达水平的比较[M(P25, P75)]

2.3 受试者外周血中IL-27、EBI3、P35及巨噬细胞相关mRNA水平的相关性IL-27 mRNA水平与EBI3、CXCL10、CXCL11、IL-10的mRNA水平变化呈正相关(r=0.234、0.320、0.291、0.272,P<0.05); CXCL10 mRNA与CXCL11 mRNA水平变化呈正相关(r=0.260,P<0.05);IFN-γ mRNA与TGF-β mRNA水平变化呈正相关(r=0.315,P<0.01),见表4。

表4 受试者外周血中IL-27、EBI3、P35及巨噬细胞相关mRNA水平的相关性(r)

2.4 活动性肺结核外周血IL-27、EBI3、P35及巨噬细胞相关mRNA的预测价值IL-27、CXCL11与IL-10的mRNA在ROC曲线下面积(AUC)分别为0.807、0.773、0.749 (P<0.001),均>0.7;其中IL-27 mRNA 的AUC值(0.807)、Youden指数(0.626)最高,其灵敏度(0.826)与特异度(0.800)均较高;P35 mRNA的AUC值无统计学意义(P>0.05)。表明IL-27、CXCL11和IL-10的mRNA水平升高对活动性肺结核有较高预测价值,以IL-27 mRNA的预测价值更为突出,见表5、图1。

图1 外周血IL-27、EBI3、P35与巨噬细胞极化相关的mRNA水平预测活动性肺结核的ROC曲线(a-c)

表5 外周血IL-27、EBI3、P35及巨噬细胞相关mRNA水平预测活动性肺结核的ROC曲线结果

3 讨论

结核的免疫结局与其病灶肉芽肿的形成发展状态密切相关,免疫过程中受到多种细胞与细胞因子的作用调节。巨噬细胞的不同亚细胞型(M1与M2极化型)、与T细胞不同亚群如T辅助细胞(Th1、Th2)、调节性T(Treg)细胞等被广泛提及;IL-12家族因子在结核中参与介导巨噬细胞迁移、各T细胞亚群的分化与免疫反应[11-12]。本研究重点关注IL-12家族因子IL-27、IL-35与巨噬细胞相关因子在活动性肺结核中的mRNA表达与预测价值。

本研究中病例组白细胞计数、C反应蛋白水平高于对照组,血红蛋白、白蛋白水平低于对照组,表明病例组存在明显的炎性消耗与炎性微环境变化[13]。结核中巨噬细胞根据炎症微环境变化可分化为不同亚细胞型,如M1型(经典激活型)与M2型(选择性激活型),两者促进不同细胞因子表达且导致不同感染状态[2]。M1极化伴随高水平的IFN-r、CXCL10、CXCL11等分泌,表现促炎表型特征,可有效抑制结核菌的感染扩散;M2极化伴随高水平IL-10、TGF-β等分泌,多体现抗炎与组织重塑作用。有研究表明肺结核患者在急性转慢性感染时出现促炎与抗炎细胞因子谱的转换,肺组织中有巨噬细胞两种极化形式共存[14]。本研究病例组中M1极化相关的IFN-γ、CXCL10、CXCL11和 M2极化相关的IL-10与TGF-β的mRNA表达水平高于对照组,证实活动性肺结核外周血同时存在M1和M2型极化因子的mRNA变化。

CXCL10与CXCL11均为巨噬细胞M1极化主要驱动因子IFN-γ诱导的趋化因子[15],两者被认为介导免疫细胞的增加与募集,有利于建立巨噬细胞抗菌的微环境[6]。研究表明CXCL10在患有双侧或空腔疾病的肺结核个体中显著升高且与细菌负荷呈正相关,CXCL11的血清评价作用在活动性肺结核中高于CXCL10,在结核性淋巴结炎中高于IFN-γ[3]。本研究中CXCL10与CXCL11的mRNA表达水平均在病例组中升高,两者表达呈正相关,CXCL11的mRNA表达水平预测活动性肺结核的价值较高,进一步表明外周血CXCL11的mRNA表达为预测活动性肺结核的潜在生物标志。

抑炎因子IL-10、TGF-β为公认的巨噬细胞M2型极化因子[16],两者下调Th1炎性反应,加速结核向明显疾病发展。本研究结果显示IL-10 mRNA表达水平预测活动性肺结核的价值较高,表明外周血IL-10的mRNA表达为预测活动性肺结核的潜在生物标志, IL-10在结核中升高并呈较为稳定的表达可能抑制了机体清除细菌的能力。

IL-27是IL-12家族细胞因子,由抗原呈递细胞 (APCs) 经Toll样受体 (TLR) 活化产生。研究表明肺结核支气管肺泡灌洗液中IL-27与趋化因子的浓度升高相关[17];此外IL-27还表现抗炎特性,抑炎因子IL-10在Th1细胞的表达被认为依赖于IL-27[18]。研究显示IL-27使细胞对TLR的反应更为敏感,表明IL-27可能参与正反馈回路[19]。本研究中病例组IL-27 mRNA表达高于对照组,且与促炎因子CXCL10、CXCL11 mRNA水平变化呈正相关,与抗炎因子IL-10 mRNA表达呈正相关,这符合既往IL-27在结核中的双重免疫特点,同时表明其变化与巨噬细胞极化因子变化有关联。IL-27 mRNA的AUC值、Youden指数高于其他所测因子,表明外周血IL-27 mRNA预测活动性肺结核的价值更高,可能与IL-27参与正反馈回路或在肺结核中更广泛的免疫调节效应有关。

IL-35与IL-27同属IL-12家族,结构上共享EBI3亚基,IL-35与IL-10、TGF-β共同调节Treg细胞相关的免疫抑制。有研究表明EBI3和P35 mRNA在活动性肺结核外周血与肺组织的单核细胞中升高,且与细菌负荷呈正相关[9];也有研究表明活动性肺结核患者的血清IL-35相对于稳定患者表达偏低,与肺结核病情程度呈负相关[20]。本研究病例组中EBI3 mRNA水平高于对照组,P35 mRNA水平稍高于对照组但差异无统计学意义;P35 mRNA的AUC值无统计学意义。分析原因可能与IL-27抑制Treg分化作用有关,潜在导致IL-35的来源丧失[19]; IL-12家族因子对结核免疫调节作用具有复杂性,其在结核进展中促炎或抑炎的作用机制尚需进一步探索。

综上,本研究初步表明,活动性肺结核外周血中巨噬细胞M1和M2极化相关mRNA水平均有变化,与IL-27 mRNA水平升高有相关性;其中IL-27、CXCL11和IL-10的mRNA水平升高对活动性肺结核有预测价值,以IL-27 mRNA的预测价值更为突出。本研究的样本量有限,且研究对象存在地区局限性,不排除因此导致的研究结果误差;关于IL-12家族因子和巨噬细胞相关mRNA对活动性肺结核的双重免疫调节效力与临床价值需要多中心大样本研究来进一步证实。