减低剂量预处理单倍体外周血造血干细胞移植术后早期免疫重建的临床研究

张友弟, 庞楠楠,2, 徐建丽, 王洪波, 陈 刚, 韩春霞, 江 明

(1新疆医科大学第一附属医院血液病中心, 新疆维吾尔自治区血液病研究所, 乌鲁木齐 830054;2中国科学院苏州生物医学工程技术研究所中国科学院生物医学检验技术重点实验室, 江苏 苏州 215163)

造血干细胞移植(HSCT)是治疗血液系统恶性肿瘤最有效的方法之一,移植术后患者免疫功能的早期快速恢复是造血干细胞移植术成功的关键,不同的移植方案及移植术后的感染发生、免疫抑制剂的应用等因素均会对免疫细胞及免疫功能重建产生一定影响,在计划移植之前要综合考虑干细胞的来源及患者的一般情况(如年龄及是否合并有其他并发症)等方面因素。由于部分患者一般情况较差,如年龄较大或合并有较严重的并发症而不能接受常规的清髓性预处理方案,错过了接受治疗的可能。2013年起本课题组就开始探索我中心制定的减低剂量预处理高剂量非体外去T细胞输注单倍体造血干细胞移植(Reduced intensity conditioning haploidentical high dose non-TCD in vitro peripheral blood stem cells transplantation, RIC-haplo-HDPSCT)模式,其特征有:预处理方案为FAB+ATG方案(氟达拉滨+阿糖胞苷+白消安+兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白);高剂量非体外去T细胞外周血造血干细胞输注;在传统的急性移植物抗宿主病(aGVHD)预防方案的基础上,使用舒莱+激素的方案。前期临床研究者[1-2]发现RIC方案适用于机体一般情况较差且年龄较大的患者,并且对这类患者临床疗效较好,课题组前期相关研究也发现该方案可获得与常规移植预处理方案相当的临床疗效[3-4]。但是,在此方案下,不同免疫细胞在移植后早期的改变特征仍不明确。探讨我中心制定的RIC-haplo-HDPSCT移植模式术后各免疫细胞变化特点及影响因素,是预防移植术后感染及复发的关键。本文初步研究从2013年1月-2022年8月用此模式移植的54例移植患者早期各免疫细胞亚群的表达情况,并且探讨了aGVHD与各免疫细胞亚群变化的相关性,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取54例2013年1月-2022年8月在本中心行RIC-haplo-HDPSCT的患者为研究对象,其中男性25例,女性29例;年龄26～66岁;疾病类型:急性非淋巴细胞白血病(AML)26例,急性淋巴细胞白血病(ALL)11例,慢性粒细胞白血病(CML)5例,骨髓增生异常综合征11例,急性NK细胞白血病(ANKL)1例。54例患者均成功植入,其中有34例患者移植术后未发生aGVHD,20例患者在移植术后 100 d内发生aGVHD,aGVHD分级:Ⅰ级10例,Ⅱ级6例,Ⅲ级2例,Ⅳ级2例。发生aGVHD的中位时间为39 d,54例患者外周血血象恢复时间为:中性粒细胞恢复天数为(18.5±4.8) d,血小板恢复天数为(18.6±6.7) d。同期在本院体检中心进行健康体检者20例作为对照组。本研究经过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准(伦理审批号:S210927-21),所有患者签署知情同意书后进行。

1.2 移植预处理方案及干细胞采集、输注FAB+ATG方案:即在移植之前的9～5 d给予每天静脉注射30 mg/m2的氟达拉滨,阿糖胞苷(Ara-c)1～2 g/m2静点;在移植之前的4～3 d静点白消安(Bu)3.2 mg·kg-1·d-1;在移植前的4～1 d内,应用2.5 mg·kg-1·d-1的抗胸腺球蛋白静脉注射。用北京泰尔茂比特optia分离机采集干细胞,采集当天输注,54例患者单个核细胞(MNC)输注中位数:14.7×108/kg;CD34+造血干细胞输注中位数:7.9×106/kg;CD3+T细胞百分比输注中位数:76%。

1.3 aGVHD的诊断及防治采用加强的GVHD预防方案,包括环孢素A、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和抗CD25单抗等,具体预防方案详见本课题组前期研究[3-4]; aGVHD的明确诊断和分级依据西雅图的诊断准则, aGVHD确诊后, 首先选择1～2 mg·kg-1·d-1的甲泼尼龙(MP),根据患者病情考虑是否联合使用其他免疫抑制剂。

1.4 方法收集患者移植前、移植后30 d、60 d、90 d及对照组的外周血标本,分别抽取3～4 mL的新鲜抗凝血液标本(EDTA抗凝剂,绿头抗凝管),用流式细胞仪(BD Canto Ⅱ)检测各免疫细胞亚群(CD3、CD4、CD8、CD19、CD56)百分比,ELISA法检测IgG、IgA、IgM细胞含量。

2 结果

2.1 移植术后未发生aGVHD患者早期各免疫细胞亚群动态变化在RIC-haplo-HDPSCT移植模式下,CD3+T细胞的数量在移植术后30 d时显著降低,术后60 d时恢复至对照组水平;CD4+T细胞在移植术后30 d时显著降低,30 d后缓慢恢复,但仍明显低于对照组;CD8+T细胞在移植术后30 d时明显降低,之后上升,在术后60 d时明显高于对照组水平;CD19+B细胞在移植术后90 d内均明显低于对照组,但呈缓慢上升趋势;CD56+NK细胞移植术后30 d时显著高于对照组,30 d后呈下降趋势,但术后60 d及90 d与对照组无差异(图1)。IgG在移植术后30 d升高,然后逐步下降,但与对照组相比,差异无统计学意义。移植术后早期IgA及IgM水平低于对照组,差异无统计学意义(图2)。

注:与对照组比较, *P<0.05。

图2 体液免疫IgA、IgG、IgM在移植术后早期的动态变化

2.2 移植术后早期发生与未发生aGVHD患者各免疫细胞表达情况的比较发生aGVHD患者CD8+T细胞及CD3+T细胞在移植术后30 d显著高于未发生aGVHD患者(P<0.05),CD56+NK细胞在移植术后30 d显著低于未发生aGVHD患者,发生与未发生aGVHD患者移植术后30 d、60 d、90 d CD4+T淋巴细胞、CD19+B淋巴细胞及体液免疫各细胞比较差异无统计学意义(图3)。

注:与未发生aGVHD患者比较, *P<0.05。

3 讨论

HSCT术后免疫系统的恢复非常复杂,受感染、GVHD等多方面因素影响。移植术后非特异性免疫系统恢复较快,而特异性免疫系统的恢复可能需要2年或以上的时间[5]。免疫细胞及功能的早期快速恢复可以增加移植物的抗白血病作用,降低移植后感染的可能性[6],不同方案移植后的免疫重建及影响因素是当前的一个热点问题,我中心前期清髓性单倍体移植方案对移植术后CD4+T细胞亚群和相关细胞因子IFN-γ、IL-17和TGF-β等的变化特点进行了深入研究,结果表明移植术后监测各免疫细胞亚群重建情况及细胞因子的动态变化对aGVHD的早期发现及指导临床治疗有重要意义[7-8]。经过多年的临床实践,本中心制定了一套RIC-haplo-HDPSCT移植方案,该方案采用高剂量的外周造血干细胞输注,并且采用加强的预防感染的特点,在早期的临床试验中,这种方法与同胞全相合具有类似的临床效果[3-4],但该方案移植术后各免疫细胞亚群的重建特点尚不清晰,国内外RIC方案术后的免疫重建规律研究报道较少,本文重点对该方案术后各免疫细胞亚群变化特点进行初步研究。

NK细胞属于机体非特异性免疫系统,是异基因造血干细胞移植术后最早重建的免疫细胞亚群,在早期介导对白血病细胞及病原体的免疫中发挥重要作用,在本研究中, CD56+NK细胞的比例在移植术后30 d左右迅速上升,且比值明显高于对照组,这与相关文献报道相似[9-10]。曹勋红及Ullah等[9-10]对异基因造血干细胞移植术后NK细胞的重建规律做了综述,发现无论是全相合、单倍体还是自体造血干细胞移植,移植术后最先恢复的免疫细胞均是NK细胞。NK细胞的重建来源于CD34+造血干细胞和骨髓前体细胞,然后迁移到外周血分化成熟,虽然NK细胞数量通常在一个月内恢复,但是获得成熟的NK细胞表型和完整的功能可能需要6个月或更长时间。

在本研究中,该移植模式下CD3+T淋巴细胞在移植术后60 d可达对照组水平,其中以CD8+T细胞恢复为主,而CD4+T细胞在移植术后恢复较为缓慢。在相关报道中表明不论移植物来源是骨髓、外周、还是脐带血,术后T细胞的免疫功能重建都需要1～2年,甚至更久[11-12],而CD8+T细胞的重建在早期较快。研究表明[13]在早期T细胞的恢复主要是移植物中过继转移的记忆T细胞的扩张,而大多数扩张的T细胞为CD8+T细胞,这可能是与CD4+T细胞相比,CD8+T细胞在淋巴细胞减少的环境中更倾向于扩张。T淋巴细胞的免疫重建在移植后有两种途径:一是胸腺依赖途径,二是非胸腺依赖途径。在移植之前,患者接受了不用程度的化学治疗,导致了对胸腺功能的损害,从而影响胸腺依赖途径T细胞的增殖,而CD8+T细胞增殖可不完全依赖胸腺功能,CD4+T细胞却依赖胸腺[14]。故而CD4+T细胞与CD8+T细胞两者的恢复速度不同,并且出现移植后长期CD4/CD8比值倒置现象。

在此移植模式下,移植术后100 d内CD19+B淋巴细胞的比值均较低;B细胞的修复主要是初始B细胞和记忆B细胞的修复,而记忆B细胞的恢复是在CD4+T细胞的辅助下进行的。受多方面因素影响,B细胞的免疫重建需要1～2年时间[15]。本研究中发现IgG在移植术后30 d内较高,这可能与预防感染早期给予患者静点丙种球蛋白有关,移植术后100 d内IgM、IgA与对照组相比无明显差异。

本研究还发现发生aGVHD的患者CD8+T细胞在移植术后30 d显著增高,与未发生aGVHD患者相比差异有统计学意义(P<0.05)。这表明CD8+T细胞数量的增多,可能预示着aGVHD的发生,有文献[16-17]提示CD8+T细胞是引起aGVHD的重要效应细胞,本研究中还发现发生aGVHD的患者CD56+NK细胞在移植术后30 d明显低于未发生aGVHD患者,表明CD56+NK细胞的延迟恢复可能与aGVHD的发生有关,宋娜[18]及Bunting等[19]研究也发现发生aGVHD患者移植术后30 d、60 d NK细胞绝对值计数均低于未发生aGVHD患者,且低水平的NK细胞计数预示着更高的重度aGVHD发生率和aGVHD总发生率。NK细胞重建与GVHD的关系一直存在争议,研究发现[20-21]NKG2A+NK细胞抑制了T细胞的增殖和活化,这表明NKG2A+NK细胞数量的减少可能是GVHD的原因,而不是结果。

综上,在RIC-haplo-HDPSCT移植模式下,移植术后早期免疫重建以CD56+NK细胞及CD8+T淋巴细胞为主,且CD8+T细胞高表达及CD56+NK细胞的延迟恢复可能与aGVHD 的发生有关,因在本研究中样本数量不多,观察时间较短,需要在今后增加样本数量,并增加对免疫细胞功能的检测以探讨其在不同情况下的免疫细胞和功能的变化,以及免疫功能的恢复与感染、GVHD和复发之间的相关性,为临床移植后免疫干预提供指导。